活體生物發光成像技術

　　技術原理

　　1. 標記原理

　　哺乳動物生物發光，活體一般是生物將Firefly luciferase基因(由554個氨基酸構成，約50KD)即熒光素酶基因整合到預期觀察的發光細胞染色體DNA上以表達熒光素酶，培養出能穩定表達熒光素酶的成像細胞株，當細胞分裂、技術轉移、活體分化時, 熒光素酶也會得到持續穩定的生物表達。基因、發光細胞和活體動物都可被熒光素酶基因標記。成像將標記好的技術細胞接種到實驗動物體內后，當外源(腹腔或靜脈注射)給予其底物熒光素(luciferin)，活體即可在幾分鐘內產生發光現象。生物這種酶在ATP，發光氧存在的成像條件下，催化熒光素的技術氧化反應才可以發光，因此只有在活細胞內才會產生發光現象，并且發光光強度與標記細胞的數目線性相關。

　　除Firefly Luciferase外，有時也會用到Renilla Luciferase。二者的底物不一樣，前者的底物是熒光素(D-luciferin)，后者的底物是coelentarizine。二者的發光波長不一樣，前者所發的光波長在540~600nm，后者所發的光波長在460~540nm左右。前者所發的光更容易透過組織，后者在體內的代謝比前者快，而且特異性沒有前者好，所以大部分活體實驗使用Firefly Luciferase作為報告基因，如果需要雙標記，也可采用后者作為備選方案。

　　熒光素酶的發光是生物發光，不需要激發光，但需要底物熒光素。熒光素在氧氣、ATP存在的條件下和熒光素酶發生反應，生成氧化熒光素(oxyluciferin)，并產生發光現象。

　　對于細菌標記，一般利用發光酶基因操縱子luxABCDE或luxCDABE，其由控制的編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成。利用這種辦法進行標記的細菌會持續發光，不需要外源性底物。但是一般細菌標記需要轉座子的幫助把外源基因插入到細菌染色體內穩定表達。

　　2. 底物熒光素的特點

　　熒光素由于諸多優點得到廣大科研人員的青睞，主要特點如下：

　　(1) 熒光素不會影響動物的正常生理功能。

　　(2)熒光素是280道爾頓的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。

　　(3) 熒光素在體內擴散速度快，可通過腹腔注射或尾部靜脈注射進入動物體內。腹腔注射擴散較慢，持續發光長。熒光素腹腔注射老鼠后約1min后表達熒光素酶的細胞開始發光，10min后強度達到穩定的最高點，在最高點持續約20~30 min后開始衰減，約3h后熒光素排除，發光全部消失，最佳檢測時間是在注射后15~35min之間;若進行熒光素靜脈注射，擴散快，但發光持續時間很短。科研人員根據大量的實驗總結出熒光素的合適的用量是150mg/kg，即體重20克的小鼠需要3毫克的熒光素。

　　(4) 觀察時間的間隔沒有最短限制，只要觀察的條件控制一致就可以。雖然底物在動物體內有一定的代謝過程，但是上一次底物的殘留曲線可以知道，可以控制對下一次觀察結果的影響。

　　3. 光學原理

　　光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收，光子遇到細胞膜和細胞質時會發生折射現象，而且不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白(hemoglobin)是造成體內可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用活體動物生物發光成像技術最少可以檢測到皮下的幾百個細胞。當然，由于發光源在老鼠體內深度的不同可看到的最少細胞數是不同的。一般認為，每一厘米深度，發光強度衰減10倍，血液豐富的組織或器官(比如心臟、肝臟、肺臟)衰減多，與骨骼相鄰的組織或器官衰減少。

　　活體生物發光成像技術應用領域

　　活體生物發光成像技術是一項在某些領域有不可替代優勢的技術，比如腫瘤轉移研究、藥物開發、基因治療、干細胞示蹤等方面。

　　1.腫瘤學

　　活體生物發光成像技術能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種癌癥模型中腫瘤的生長、轉移以及對藥物的反應。其特點是極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶(少到幾百個細胞)也可以被檢測到，比傳統方法的靈敏度大大提高了;非常適合于腫瘤體內生長的定量分析;避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異;節省動物成本。由于以上特點，使基于轉移模型、原位模型、自發腫瘤模型等方面的腫瘤學研究得到發展。建立腫瘤轉移模型，可以觀察腫瘤轉移情況，進一步探討腫瘤轉移的機制;可進行原位接種，觀察原位以及原位轉移模型，使腫瘤學研究更接近腫瘤臨床發病的微觀環境;通過建立自發腫瘤模型，可以觀察腫瘤發生機理。

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