【背景介紹】31
金納米粒子（AuNPs）由于其優(yōu)異的綜述光學性質，在生物傳感相關的用于用發(fā)展中得到了廣泛的應用。肽作為一種新型的分相功能性生物分子，有望取代抗體、互作化肽受體和底物進行特定的綜述分子相互作用。肽和AuNPs都是用于用穩(wěn)定的，并且容易合成，分相制備成本都相對較低。互作化肽因此，綜述基于肽AuNPs的用于用生物納米技術越來越受到人們的關注，特別是分相在分子靶向、細胞成像、互作化肽藥物傳遞和治療等領域。綜述
【成果簡介】
最近，用于用奧地利國家技術研究院Wolfgang Knoll教授、分相新加坡南洋理工大學Bo Liedberg教授和溫州醫(yī)科大學王毅研究員綜述了近年來關于功能化肽-金雜化納米材料的最新研究進展。以“Rational Design of Functional Peptide-Gold Hybrid Nanomaterials for Molecular Interactions”發(fā)表于Adv. Mater.期刊上。在本文中，作者從肽功能化的角度對肽-金（主要是AuNPs）雜化納米材料進行研究，并討論了其包括生物傳感、細胞靶向、成像以及抗菌防污涂層的開發(fā)等生物方面的應用。作者介紹了過去25年來肽-金雜化納米材料應用的發(fā)展，從著名的DNA-AuNPs組裝，到分子識別和組裝的肽-AuNPs被深入研究并應用于各個生物醫(yī)學領域，如體外酶分析、細胞靶向相關分析如細胞成像、細胞結合、穿透和核靶向、腦-血屏障（BBB）易位和癌癥治療等。作者還介紹了最近的肽-AuNPs的新功能/應用，如催化劑、抗菌劑、輔助多光子顯微鏡和手性AuNPs結構的形成等等，并為這一研究課題提供了新的方向。
【圖文解讀】
1、引言
圖一、這篇綜述的結構示意圖
圖二、在過去25年中，肽-金納米粒子在開發(fā)應用方面的重要歷程
2、相互作用的肽與AuNP結合物
2.1、功能化合成肽
圖三
（A）從噬菌體庫（噬菌體表面不同顏色的多肽）開始噬菌體展示示意圖。接下來的肽選擇是通過結合（藍色）、洗脫（藍色和非特異性橙色）和擴增的循環(huán)來完成的。非特異性肽（橙色）被多重選擇循環(huán)邊緣化；
（B）上部：肽設計，結合位點有一個連續(xù)序列（粉紅色）作為表位。下：肽設計，三個肽段（黃色、綠色和紅色）位于結合袋中，由分子支架連接，以模擬天然蛋白質的三維結構；
（C）單壁碳納米管（SWNT）結合肽結構預測的分子動力學模擬。
2.2、多肽對AuNPs的穩(wěn)定作用
圖四
（A）與其他兩種肽相比，固定化后具有特殊穩(wěn)定性的保護性五肽（CALNN）的選擇性；
（B）互補肽折疊誘導的AuNP聚集：異源二聚；
（C）AuNP聚集誘導的肽折疊：同源二聚；
（D）功能化AuNP作為模板將合成肽折疊成α螺旋結構。
2.3、肽-AuNP結合物的受控相互作用
3、基于肽-金雜化納米材料的靶向分子
3.1、肽-金底物用于酶分析
3.1.1、水解反應
圖五
（A）利用設計的肽和AuNPs比色蛋白酶傳感過程示意圖；
（B）用設計的His6末端肽和金屬離子進行蛋白酶羧保護AuNP比色分析示意圖；
（C）培養(yǎng)60分鐘后，在存在或不存在鎳離子的情況下，含有不同肽的溶液中的羧基AuNP照片（1:AuNP，2:AuNP/His6-pep，3:AuNP/His6-pep/Ni2+，4:AuNP/His6-pep-His6，5:AuNP/His6-pep-His6/Ni2+）；
（D）通過蛋白水解去除末端疏水基團，蛋白酶可裂解的Fmoc剩余肽修飾聚合的AuNPs，其再分散的示意圖和相應的TEM圖像；
（E）設計的肽結構:1、完整的熱溶酶肽底物，2、裂解后；
（F）添加酶前（實線）和酶孵育6小時后1-AuNPs的紫外-可見光譜（虛線）；
（G）250和45 ng·mL?1熱溶酶肽在5分鐘間隔內的預聚集1-AUNP（用Δ比率A/D表示）的再分散水平。
圖六
（A）MMP-7在AuNPs上裂解底物肽誘導的聚集過程示意圖；
（B）用MMP-7蛋白酶消化前（+，黑色）和消化后（+，紅色），金表面圖案肽底物的橢圓偏振對比圖像，具有相應的高度分布；
（C）使用兩種肽設計（1和2）和生物功能化AuNPs進行BoLcA檢測的混合和橋接分析；
（D，E）用100 nM的BoLcA D）和預孵育（作為對照）E）后的navi-AuNPs和1-AuNPs混合物溶液的歸一化消光光譜。插圖是顯示顏色變化的相應AuNP溶液的照片。
圖七
（A）熒光染料標記肽底物和表面反應性AuNPs組成了熒光染料熒光探針的總體方案；
（B）肽功能化AuNP和鏈霉親和素之間能量轉移的示意圖-alex488（SA488）在BoLcA催化裂解之前（猝滅）和之后（恢復）；
（C）用不同濃度的BoLcA（1 pM，10 pM，100 pM，1 nM，3 nM，10 nM）和胰蛋白酶（10 pM和1 nM）預處理的1.4 nM AuNP-pep上，SA488的熒光強度隨時間而變化；
（D）(C)中2小時反應時間對應的BoLcA檢測校準曲線；
（E）用AuNP肽QD結合物檢測蛋白酶原理及抑制劑篩選示意圖；
（F）用蛋白酶特異性肽底物與AuNPs結合的各種量子點，在玻璃上顯示其相應的顏色（綠色：MMP-7，紅色：caspase-3，橙色：凝血酶）的復合蛋白酶分析示意圖。
圖八
（A）以中性親和素包被的AuNP為核心，生物素化肽AuNP作為衛(wèi)星組成的冠納米顆粒探針示意圖；
（B）caspase-3介導的冠納米顆粒探針裂解示意圖；
（C，D）Caspase-3裂解導致冠納米顆粒探針的分解過程，如C）散射圖像：紅色到黃色到暗綠色斑點，以及D）光譜：最初從654 nm（紅色）藍移；
（E）逐級強度下降表明單衛(wèi)星納米顆粒分裂；
（F）在顯微鏡圖像中，明亮的和紅色的斑點顯示細胞將冠狀納米顆粒探針通過細胞穿透肽(Thr-Ala-Thr)遞送到HeLa和SW620；
（G）在加入凋亡誘導劑（TNF-α和CHX）后，細胞內的Caspase-3活性逐漸變?yōu)榘导t色/綠色，而在沒有凋亡誘導劑或添加Caspase-3抑制劑（z-DEVD-fmk）的細胞中，沒有觀察到信號變化。
圖九
（A）基于設計的肽底物和AuNPs的比色法ALP分析示意圖，其中肽中磷酸酪氨酸的負電荷阻止AuNP聚集，直到ALP去除肽上的磷酸基團，導致肽橋接AuNP聚集，然后變色；
（B）堿性磷酸酶的比色分析顯示，隨著時間的推移，顏色以劑量依賴的速率逐漸變化；
（C）通過比較650 nm處的吸收強度與堿性磷酸酶抑制劑（p-BO）濃度，得到了基于相同比色系統(tǒng)的堿性磷酸酶抑制試驗的動力學曲線；
（D）基于磷酸化二肽存在下合成AuNPs的比色ALP分析示意圖；
（E）照片顯示了在ALP預處理存在(+)和不存在(?)情況下，與一系列肽濃度合成的AuNPs的顏色差異；
（F）基于設計的生物素化二甲基化肽底物和抗二甲基抗體的親和素包被AuNPs的比色LSD1分析示意圖。
3.1.2、磷酸化反應
圖十
（A）生物素化與經激酶修飾的底物肽磷酸化配對的示意圖，在添加親和素包被的AuNPs后導致隨后的聚集（顏色變化），而在存在激酶抑制劑的情況下，未觀察到聚集（紅色殘留）；
（B）基于AuNP聚集的比色激酶活性測定：帶正電的肽底物在沒有激酶的情況下誘導AuNP聚集（顏色變化），而PKA激酶反應后，由于正電荷丟失，肽不再誘導AuNP聚集；
（C）抑制劑H-89對PKA活性的抑制作用；
（D）基于設計的肽功能化AuNPs和抗磷酸鹽抗體AuNPs的比色激酶分析示意圖：由激酶導致AuNP混合物聚集的肽磷酸化；
（E）在不存在激酶（折線）和v-Src-激酶（實線）的情況下混合AuNPs溶液的紫外-可見光譜。插圖：顯示相應AuNPs溶液的TEM圖像。
圖十一
（A）基于RLS的PKA及其抑制分析示意圖：在PKA存在下，設計肽底物的生物素化和磷酸化導致親和素涂層的AuNPs附著，然后銀沉積以增強RLS信號；
（B）基于設計的肽模板金納米團簇的熒光PTM酶分析示意圖。PTM修飾的肽底物使熒光共軛納米材料猝滅；
（C）隨著HDAC-1濃度的增加，熒光發(fā)射光譜逐漸下降；
（D）利用設計的肽功能化AuNPs進行基于表面電荷檢測的激酶活性測定示意圖；
（E）AuNPs和AbI1激酶濃度的表面zeta電位校準曲線；
（F）飛行時間二次離子質譜顯示，激酶反應后肽底物分子量直接增加，相當于HPO3分子量，伴隨著原始信號強度的降低。
3.2、肽結合物用于生物傳感和細胞靶向
3.2.1、用于生物傳感
圖十二
（A）基于所設計的肽結合物功能化AuNPs的蛋白質分析物檢測原理示意圖。Zn2+離子誘導的肽折疊導致了AuNPs的聚集，而HCAII等蛋白質分析物的結合阻止了肽的折疊和隨后的聚集；
（B，C）在不存在B）和存在C）HCAII蛋白質的情況下，添加10 mM Zn2+離子后，以2分鐘間隔記錄20分鐘的紫外-可見光譜；
（D）基于肽粘合劑和AuNPs的Ag+比色檢測示意圖。添加Ag+后肽鍵的折疊誘導AuNPs的聚集；
（E）基于肽官能化AuNPs絡合比色法檢測金屬離子示意圖；
（F）不同功能性肽對金屬離子的比色響應。
圖十三
（A）用不同大小和濃度的肽粘合劑功能化AuNPs檢測cTnI的示意圖。簡單加入靶cTnI后，以濃度依賴的方式誘導快速聚集；
（B）針對100 ng mL?1cTnI，繪制了與AUNP不同相對表面積（每種尺寸的四種稀釋因子：16 nm，黑色正方形；25 nm，紅色圓圈；36 nm，藍色三角形）的峰值（質心）偏移；
（C）基于肽功能化AuNPs的CB[8]分子存在下比色檢測Flt-1的示意圖；
（D）含有靶病毒表位、連接子（GGG）和半胱氨酸殘基的肽的線性結構；
（E）在相應的肽基表位包被的AuNPs溶液中添加200 nM單克隆抗體后，每隔10分鐘記錄一次紫外-可見光譜，表明存在大量聚集。
圖十四
（A）固定PEG層（黑色）和抗體（綠色）后，裸金（橙色）的代表性LSPR光譜，以及外顯體（紅色）的最終檢測，并附有簡單的示意圖。掃描電子顯微鏡（SEM）顯示了外顯體與金納米孔的結合；
（B）nPLEX法與ELISA法的敏感性比較，nPLEX法測定不同濃度外顯體的結果優(yōu)于ELISA法；
（C）基于抗菌肽magainin I及其結構（彩色α-螺旋）的細菌電檢測示意圖，包括在金微電極陣列上的固定和靶菌的結合；
（D）在10赫茲下對不同濃度大腸桿菌進行阻抗測量，估計LOD為103 cfu mL?1（≈1個細菌/μL）；
（E）肽結合物電化學檢測諾如病毒的工作流程示意圖，包括噬菌體展示技術的肽選擇（1）、肽結合物（1-2）的設計和合成、固定化（2-3）和試驗（3-4）。
3.2.2、用于細胞靶向和后續(xù)應用
圖十五
（A）柱狀圖顯示肽5（ConG序列：GEXXLQXNQXLIRXKSNC，X:γ-羧谷氨酸鹽，末端C固定化）功能化AuNPs（AuNP-5）與HEK 293細胞表面NMDA受體的選擇性結合；
（B）與經AuNP-6處理的細胞（右，幾乎找不到）相比，AuNP-5與轉染細胞選擇性結合的掃描電鏡圖像（左，許多亮點）；
（C）AuNP-5與轉染細胞的結合曲線表明，由于多價性，結合親和力比游離ConG提高了一千倍；
（D）肽功能化AuNPs選擇性靶向細胞整合素GPIIb/iia用于成像（i）和定量比色傳感（ii）的示意圖；
（E）培養(yǎng)細胞暴露于120 n M肽-AuNPs（第一行）和作為陰性對照的分散介質（第二行）的明場（第一列）和雙光子熒光（第二列）圖像，表明了這種納米探針的特異性；
（F）線性擬合曲線將細胞數(shù)與AuNPs濃度（紅色）和色度信號（藍色）相關聯(lián)，從而能夠計算出每個細胞表面上整合素GPIIb/iia的數(shù)量。
圖十六
（A）靶向p32表達MDA-MB-435細胞的天然LyP-1肽的化學結構；
（B）LyP-1肽（紫圈）通過點擊化學和靶向表達受體（紅色）的azido-PEG包被AuNPs上的功能化示意圖；
（C）靶向癌細胞的LyP-1-AuNPs熒光圖像（右）顯示近紅外熒光增強（紅色），而疊氮-PEG-AuNPs作為對照（左）則沒有觀察到可檢測的信號；
（D）含BSA蛋白的特異性核靶向肽AuNPs功能化示意圖；
（F）pHLIP-EuL-AuNPs易位到細胞的示意圖。該機制主要是由于pHLIP-EuL-AuNPs處理的人血小板在較低的pH導致其pHLIP的構象由無規(guī)卷曲變?yōu)槁菪?/p>
（G，H）未處理G)和經pHLIP-EuL-AuNPs處理H)的人血小板的TEM圖像。后者顯示納米顆粒能穿透各種血小板結構，如小泡（v）、開放小管系統(tǒng)（ocs）和細胞質（c）。
圖十七
（A）肽的設計和通過內吞小泡從血液到大腦的肽轉移示意圖。該肽包含識別轉鐵蛋白受體的THR序列和針對腦內Aβ聚集物的LPFFD序列；
（B）大鼠腦中不同的金含量表明，與其他對照組相比，通過血腦屏障傳遞的THR-CLPFFD-AuNPs量最高；
（C）用于治療和診斷目的的TAT-AuNPs注入腦腫瘤的示意圖。治療藥物（Dox）通過pH敏感連接物（左上）與TAT-AuNPs連接；MRI造影劑（Gd3+）螯合在TAT-AuNPs上，最終在腫瘤細胞（右上）中積聚；
（D）注射Dox-TAT-AuNPs后，用H&E（組織結構）和銀增強（AuNPs）染色的小鼠腦組織的顯微圖像，顯示納米顆粒在腫瘤上的定位；
（E）顱內腫瘤荷瘤小鼠靜脈注射Dox-TAT-AuNPs（red）后的Kaplan-Meier生存曲線與相同劑量Dox的其他對照組比較；
（F）Gd3+-TAT-AuNPs注射24小時后荷瘤小鼠的T2加權MRI水平切片（紅色虛線圓圈：腫瘤組織）；
（G、H）相同治療方法的荷瘤小鼠的組織學研究。腦組織經H&E和銀增強染色（黑點：增強AuNPs）；
（J）BBB滲透性Angioppe2肽功能化對酸敏感的AuNPs示意圖。生理酸性條件下觸發(fā)PEG層脫膜后，兩種納米粒（疊氮-和炔基-）通過點擊化學聚集，最終在腦腫瘤組織中積聚；
（K）在注射混合功能性AuNPs之前、1小時和24小時后，移植瘤小鼠的腦T1加權MRI，顯示由于納米顆粒在膠質瘤邊緣積聚，信號增強（黃色箭頭）；
（M）注射混合功能AuNPs后24小時膠質瘤腦組織的組織學和拉曼光譜圖像：虛線以上區(qū)域。
4、肽-金雜化納米材料的其他應用
4.1、抗菌活性
圖十八
（A）萬古霉素結合AuNP與VRE菌株之間多價相互作用的示意圖；
（B）萬古霉素定向合成AuNPs的反應機理；
（C）在不同實驗條件下，在CM-SH和CM肽存在下合成AuNPs；
（D）通過碳二亞胺化學將1018K6肽與聚合物AuNPs偶聯(lián)；
（E）抗菌肽偶聯(lián)陽離子AuNPs的制備及其與pDNAs和細胞相互作用的示意圖。
4.2、防污性能
圖十九
（A）包含分子識別部分（RGD，紫色）、超低污染部分（EK repeats，藍色）和表面錨定部分（PPPPC，綠色）的自組裝單分子膜的肽序列；
（B）用表面等離子體共振法（SPR）測試了在防污肽（含有EK重復序列和PPPPC作為連接劑的肽）表面活性劑（SAM）上的蛋白質吸附，纖維蛋白原（黑色）和溶菌酶（白色）的表面活性劑（SAM）與其他兩種相比幾乎沒有附著;
（C）細胞粘附圖像顯示，隨著RGD肽百分比的增加（從0%增加到100%），在肽單層上培養(yǎng)的細胞密度增加；
（D）巰基化兩性離子肽在金表面自組裝過程示意圖；
（E，F(xiàn)）非特異性蛋白質結合在兩性肽和兩親/非離子肽上，分別與簡單溶液（E）和天然復合溶液（F）結合。兩性肽（白色）比兩親性/非離子肽（黑色）具有更好的防污性能；
（G）用His（No:1-3）自組裝到帶正電荷的AuNPs上的設計肽的示意圖，這使得利用底物Cbz-Phe-ONP催化酯交換反應；
（H）由Zn2+離子觸發(fā)的分散和聚集JR2EC AuNPs的示意圖（上）及其在多光子激光掃描顯微鏡中的可視化（下）。
4.3、其他類型的功能肽
5、未來的挑戰(zhàn)與機遇
【小結】
綜上所述，作者總結了近些年用于分子相互作用的功能化肽-金雜化納米材料的最新研究進展。作者認為，利用肽-金納米共軛物對抗新型靶標來實現(xiàn)新的傳感/靶向策略是非常具有挑戰(zhàn)性的。盡管目前已經開發(fā)了許多基于肽-AuNP的分析方法，但大多數(shù)方法只與一小部分靶點發(fā)生冗余作用。比如大多數(shù)酶反應偶聯(lián)物只針對一些催化反應：蛋白質水解和（de）磷酸化。但隨著許多在特定病理過程中起關鍵作用的其他酶的檢測已經利用肽-AuNPs發(fā)展起來。作者認為利用特定設計的肽或肽輔助組裝手性結構的AuNPs（手性等離子體光子學）檢測/篩選手性分子/藥物的機會仍然存在。作者指明，具有設計構象的肽可能為手性分子的對映選擇性檢測或分離提供高親和力以設計功能肽。此外，可以從這些溫和肽中設計出合適的肽陣列，并將其作為一個功能單元來利用，從而模擬傳感。而在另一方面，提高肽-AuNPs基傳感器的敏感度也是一個極為重要的發(fā)展方向。這可以通過改變AuNPs的形狀或構建新的納米組裝體以監(jiān)測周圍環(huán)境局部折射率的微小變化，以及使用肽-AuNPs的FRET策略、與電化學或者拉曼光譜等組合方法用于提高各種檢測的靈敏度。最后，作者認為將功能性肽-AuNP結合物應用于現(xiàn)場試驗或臨床診斷/成像和治療是另一個極具挑戰(zhàn)性的研究方向。然而，大多數(shù)生物傳感工作仍然局限于相對清潔的水環(huán)境中。這對靶分子具有溫和親和力的肽受體可能適用于需要自發(fā)可逆結合的實時臨床監(jiān)測，同時還要有體內毒理性方面影響的考慮。此外，肽-AuNPs的實際應用還需考慮到簡單性、成本和生態(tài)效率等方面因素。總之，功能性肽金納米材料已被廣泛應用于靶向性應用，作者預計新的肽設計和納米技術將為未來在生物醫(yī)學領域和其他領域的應用鋪平道路。作者認為，面對高靈敏度和特異性解決真實/臨床樣本檢測的挑戰(zhàn)，細胞靶向/成像和醫(yī)學治療將是醫(yī)學、生物工程、表面和材料科學界長期需要解決的問題，而肽-AuNPs則有望為其發(fā)展提供一個理想的技術平臺。
文獻鏈接：Rational Design of Functional Peptide‐Gold Hybrid Nanomaterials for Molecular Interactions（Adv. Mater.2020, 2000866.）
【王毅教授簡介】
溫州醫(yī)科大學眼視光學院、生物醫(yī)學工程學院教授，中國科學院大學溫州研究院研究員，浙江省海外高層次人才計劃特聘專家。2010年獲德國美因茨大學、德國馬普高分子所博士學位。之后在奧地利國家技術研究院、新加坡南洋理工大學從事科研工作。近年來，團隊主要在SPR和拉曼傳感器的開發(fā)、生物和納米復合材料等生物化學傳感器方面開展研究工作，應用于臨床腫瘤診斷、神經組織成像等。現(xiàn)主持國家重點研發(fā)計劃項目（課題）、國家自然科學基金、浙江省杰出青年科學基金等項目。截止目前在Advanced Materials, Chemical Science, Analytical Chemistry, Biosensors and Bioelectronics等期刊發(fā)表SCI論文50余篇，H指數(shù)26，英文著作3部，申請發(fā)明專利15項。
近年來，王毅團隊與其合作者利用多肽-金納米顆粒混合材料在生物傳感領域進行了系列的研究，包括：通過自行設計的多肽底物結合金納米顆粒進行神經毒素的比色法和熒光淬滅法檢測（Analytical Chemistry, 2014, 86,?2345-2352；Chem Sci, 2014, 5,?2651-2656.），總結了由不同形狀、大小等金納米顆粒進行肉眼可識別比色法的規(guī)律（Analytical Chemistry, 2018, 90: 4916–4924.），利用篩選出的多肽結合分子修飾的金納米顆粒進行心肌肌鈣蛋白的比色法和電化學檢測，并細致分析了納米顆粒的大小和濃度，以及外加電壓對檢測限的影響（Analytical Chemistry, 2016, 88,?11924-11930; ACS Sensors, 2016, 1,?1416-1422；Nanoscale2015, 7,?17244-17248.），同時利用了智能手機作為光譜檢測平臺進行便攜檢測（Biosensors and Bioelectronics2018, 99, 312-317；Analyst, 2016, 11,?3233-3238.）。
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