鯊魚肝油是中性烷基甘油、角鯊烯等生物活性物質的氧化重要來源，具有良好的鋁柱生理保健功能。烷基甘油是層析純化醇制成分一種醚脂質化合物，根據甘油骨架上連接的分離烷烴鏈飽和度與長度的不同，主要分為鯊肝醇(十八烷氧基甘油)、鯊肝鯊油醇(十八-烯烷氧基甘油)、品及鮫肝醇(十六烷氧基甘油)等。其組其中，中性鯊肝醇是氧化烷基甘油重要的組成部分。具有對抗因細胞毒類藥物或苯中毒引起的鋁柱造血系統抑制，抗癌、層析純化醇制成分防癌，分離促進白細胞增生及抗放射線等作用，鯊肝是品及重要的免疫刺激因子。目前鯊肝醇富集工藝較為不成熟且不同原料中的鯊肝醇含量參差不齊，在售的鯊肝醇產品為富含鯊肝醇的鯊魚肝油，大多為化學合成，而化學合成的鯊肝醇存在生物活性功效低下等問題。
目前，國內外鯊肝醇分離、純化的方法主要有超臨界流體法、分子蒸餾法、酯交換法、柱色譜法、薄層色譜法(TLC)等。Vazquez等同采用超臨界流體萃取技術分離、純化鯊魚肝油中的鯊肝醇，得到高純度的鯊肝醇。然而，超臨界流體萃取法設備投入高，操作相對復雜。郭正霞利用氧化鋁柱層析技術分離、純化鯊肝醇，使鯊魚肝油不皂化物中鯊肝醇含量明顯提高。其未考察洗脫液、洗脫流速等因素對柱層析效果的影響。本研究以鯊魚肝油中不皂化物為原料。采用中性氧化鋁柱層析分離、純化鯊肝醇的工藝，通過氣相色譜法(GC)與薄層層析法(TLC)分析制備樣品中角鯊烯等活性物質，以期為鯊肝醇富集工藝及鯊魚肝油的高值化利用提供技術支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
粗制鯊魚肝油，海力生集團有限公司：鯊肝醇標品(純度≥98％)、硅烷化試劑(VBSIFA：VTMCS=99:1)、100～200目中性氧化鋁，國藥集團化學試劑有限公司；角鯊烯標品(純度≥99％)，美國Sigma公司；氫氧化鉀、乙醇(95％)、鹽酸、二氯甲烷、正己烷、無水甲醇、乙醚、乙酸等均為分析純級，國藥集團化學試劑有限公司。
1.2 儀器與設備
7890B氣相色譜儀，美國Agilent公司；電子天平AL204型，梅特勒-托利多有限公司；層析柱(φ3.0cm×60cm)、硅膠板(φ5.0cm×10.0cm)，國藥集團化學試劑有限公司；旋轉蒸發儀RE-3000，上海亞榮生化儀器廠：SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿易有限工藝；BT50S蠕動泵，上海博迅醫療生物儀器股份有限公司：Fresco-21G臺式離心機，美國ThermoFisher公司：Milli-pore超純水系統，美國Millipore公司。
1.3 試驗方法
1.3.1 不皂化物的提取參
考GB/T5535.2-2008《動植物油脂不皂化物測定第2部分：己烷提取法》和葉虔臻等的方法提取鯊魚肝油中不皂化物。稱取50g鯊魚肝油于500mL三頸燒瓶中，加入150mL1mol/L氫氧化鉀-乙醇溶液，在70℃條件下反應50min。待反應結束后，從冷凝管頂部加入150mL蒸餾水，冷卻至室溫，再將反應液倒入500mL分液漏斗中，用200mL正己烷萃取3次。合并萃取液，然后用10％乙醇水溶液清洗萃取液至中性。若在清洗過程中出現乳濁現象，則加少量無水乙醇破乳。萃取液經無水硫酸鈉脫水、旋蒸得不皂化物，充氮后低溫保存備用。
1.3.2 層析柱的制作
參考龔金炎等的方法制作中性氧化鋁層析柱。稱取250g粒徑100～200目的中性氧化鋁與500mL蒸餾水混合，加入濃鹽酸，調節溶液pH值至2，保持10min后用蒸餾水洗滌至中性。置105℃條件下活化24h。采用干法裝柱。待氧化鋁界面不再下降。用二氯甲烷洗脫除柱子中的雜質，平衡2h，靜置待用。
1.3.3 TLC檢測
參考郭正霞的方法對樣品進行TLC檢測，并作適當修改。具體操作如下：取硅膠板置于103℃條件下干燥活化1h。放入干燥器中冷卻至室溫待用。稱取樣品100mg溶解于1mL二氯甲烷中，毛細管點樣于TLC硅膠板上，以V正己烷:V乙醚:V乙酸=85:15:1為展開液，碘蒸氣顯色。
1.3.4 GC測定鯊肝醇
將TLC硅膠板上對應的鯊肝醇條帶刮下，加入500μL硅烷化試劑(VBSTFA:VTMCS=99:1)，于65℃水浴30min，冷卻后氮氣吹掃，脫除多余溶劑后加入2mL正己烷復溶，過濾待測。加入硅烷化試劑的目的是進行衍生化處理。
氣相色譜條件：HP-5毛細管色譜柱(30m×0.32mm，0.25μm)；升溫程序：初溫200℃保持5min后，以5℃/min升至280℃，保持20min；進樣口溫度250℃，不分流進樣，進樣量1μL，載氣流速1mL/min。因鯊肝醇標準品需衍生化處理后方可GC檢測。故無法繪制標準曲線。本試驗采用峰面積歸一化法分析鯊肝醇的純度。每組樣品重復測試3次。
1.3.5 GC測定角鯊烯氣
相色譜條件：HP-5毛細管色譜柱(30m×0.32mm，0.25μm)；升溫程序：初溫160℃，以15℃/min升至220℃，保持2min；然后以5℃/min升至280℃，保持20min；最后以5℃/min升至300℃，保持2min。進樣口溫度250℃，分流比1:10，進樣量1μL，載氣流速1mL/min。每組樣品重復測試3次。
準確稱取25mg角鯊烯標準品于25mL容量瓶中，加入少量正己烷定容至刻度，配制1mg/mL角鯊烯標準儲備液。分別取一定量的標準儲備液用正己烷稀釋。配成質量濃度分別為20，50，100，200，400μg/mL及800μg/mL的標準工作液。以各質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制角鯊烯標準曲線。
1.3.6 響應面試驗設計
在單因素試驗的基礎上，依據DesignExpert8.0軟件中的Box-Behnken設計中心組合試驗，選取洗脫液比例、上樣量和洗脫流速3個因素，每40mL為1個收集單位，以鯊肝醇純度為響應值，做三因素三水平的中心組合試驗，以確定氧化鋁柱層析分離富集鯊肝醇最佳工藝參數。響應面因素水平及編碼值見表1。
相關鏈接：氧化鋁柱，角鯊烯，二氯甲烷，乙醚
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