HRP的試劑底物

　　HRP催化過氧化物的氧化反應，最具代表性的盒酶過氧化物為H2O2，其反應式如下：

　　DH2+ H2O2 D+ H2O

　　上式中，試劑DH2為供氧體，盒酶H2O2為受氫體。試劑在ELISA中，盒酶DH2一般為無色化合物，試劑經酶作用后成為有色的盒酶產物，以便作比色測定。試劑常用的盒酶供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。試劑

　　OPD氧化后的盒酶產物呈橙紅色，用酸終止酶反應后，試劑在492nm處有最高吸收峰，盒酶靈敏度高，試劑比色方便，是HRP結合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。曾有報道OPD有致異變性，操作時應予注意。OPD見光易變質，與過氧化氫混合成底物應用液后更不穩定，須現配置現用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發泡助溶劑，使用更為方便。過氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時用蒸餾水稀釋。先進的ELISA試劑盒中則直接配成含保護劑的工作濃度為0.02% H2O2的應用液,只需加入OPD后即可作為底物應用液。

　　TMB經HRP作用后共產物顯藍色，目視對比鮮明。TMB性質較穩定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有無致癌性等優點，因此在ELISA中應用日趨廣泛。酶反應用HCL或H2SO4終止后，TMB產物由藍色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為405nm。

　　ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

　　另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經HRP作用后，產物顯熒光，可用熒光光度計測量。用于ELISA的優點為可加寬定量測定的線性范圍。

　　HRP對氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide)。H2O2應用最多，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便、穩定。試劑盒供應尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫(2～8℃)可穩定1年。

　　AP的底物

　　AP為磷酸酯酶，一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應后，黃色可穩定一時間。

　　AP也有發熒光底物(磷酸4-甲基傘酮)，可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。

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