文丨陽光德美
治療性蛋白藥物的治療免疫原性是指治療性蛋白和/或其代謝物誘發對自身或相關蛋白免疫應答或免疫相關事件的能力。免疫反應的性蛋性分析產生影響廣泛，從無臨床意義抗藥抗體的白藥暫時出現，到能夠改變藥物藥效或產生副作用，物免甚至嚴重到危及生命，疫原因此免疫原性研究一直是治療藥物研發的重要組成部分，貫穿藥物研發-非臨床研究-臨床研究-上市后藥物監測的性蛋性分析整個生命周期。藥物免疫原性研究有利于優化藥物臨床使用方案，白藥提高藥物的物免臨床應用范圍，降低副作用，疫原甚至決定了藥物研究的治療成敗。
免疫原性研究一直是性蛋性分析藥物評價的一個難點，涉及免疫學、白藥藥理學、物免毒理學、疫原臨床醫學、統計學等多個學科，存在研究內容多，機理復雜，成熟實驗方法少，業界認識不統一等諸多問題。本文就治療性蛋白藥物免疫原性的分析進行簡單梳理。
免疫原性的形成機制及其影響因素
1、免疫原性的形成機制
治療性蛋白引起的機體免疫反應既包括固有免疫又包括適應性免疫（細胞免疫和體液免疫）。固有免疫主要由微生物污染等導致，一般討論較少，更多的是對于治療性蛋白的適應性免疫反應的討論與監測。適應性免疫既包括細胞免疫介導的細胞因子釋放作用，又包含體液免疫介導的抗藥抗體的產生。
圖1 FDA關于治療性蛋白免疫原性產生機制的示意圖
細胞免疫一般過程包括T細胞的分化以及細胞因子的釋放，可以引起不同T細胞亞型的比例的變化和外周細胞因子水平的變化。
體液免疫主要通過B細胞產生的針對治療性蛋白的抗藥抗體（anti-drug antibodies, ADAs）來發揮作用。抗藥抗體不僅包括結合藥物的抗體（binding antibodies，BAbs），也可以是阻斷其功能的中和抗體（neutralizing ADAs，NAb）。根據產生機制通常可分為T細胞依賴途徑和非T細胞依賴兩種機制。實際上，由于免疫復合物或者聚集物都能夠從不同程度上激活這兩種途徑，并且，兩種途徑均會產生ADA，使得這兩種機制并無明顯區別，并且，它們會相互作用，相互增加對方的作用強度。
T細胞依賴途徑
T細胞依賴途徑產生的免疫應答以強度高和持續時間長為特征，這種應答啟動后，體內的記憶細胞會在機體再次遇到相同的抗原時產生免疫反應。當抗原侵入機體，抗原呈遞細胞（antigen presenting cells, APCs）通過吞噬或者胞飲作用，將蛋白降解為線性抗原多肽片段。體內重要的抗原呈遞細胞有樹突狀細胞（inhibitory dendritic cells, iDCs）、巨噬細胞、B細胞。T細胞活化需要CD4+輔助，且需要雙信號的共同激活：抗原多肽與主要組織相容性II類分子（major histocompatibility complex-2, MHC-II）結合形成MHC II-抗原多肽復合物，表達于APCs表面，供TCR識別和結合；這個過程需要APCs表面的共刺激分子（如CD86或CD80）同時與T細胞表面的協同刺激分子（如CD28）結合。被激活的T細胞發生增殖，分泌特異的細胞因子激活B細胞，B細胞增殖分化，分泌ADA。最初形成的是具有低親和力的IgM型ADA。隨著B細胞持續分化，在細胞因子的參與下，ADA可發生類別轉換，產生IgG、IgA、或者IgE型ADA。IgG型ADA與藥物具有較高的親和力，是最典型、最常見的ADA類型。此外，在T細胞依賴途徑中，少數B細胞會分化為具有較長記憶功能的記憶性B細胞，當在機體再次遇到相同抗原刺激時分泌抗體。
非T細胞依賴途徑
無T細胞參與，機體針對治療蛋白聚集物也可以產生ADA，即非T細胞依賴途徑。呈多聚體結構的藥物或ADAs免疫復合物可以直接與B細胞表面受體（B cell receptors , BCR）結合，使BCR發生低聚化、內化，激活B細胞，促使B細胞分化和增殖，產生ADA。沒有T細胞輔助，該途徑產生的ADA不會發生類別轉換，所以該途徑分泌的ADA主要IgM型，親和力低、持續時間短、特異性差，且不如T細胞依賴的免疫應答作用強。此外，該途徑不區分自身抗原和非自身抗原，即使是自身抗原，若形成50到100 ?的緊密多聚體形式，B細胞也可能會被激活產生ADA。
圖2 抗藥抗體的產生機制
2、影響免疫原性的因素
雖然所有治療性蛋白藥物均有誘發免疫反應的潛能，但不同的治療性蛋白藥物其發生免疫反應的可能性不同。免疫原性的產生是由多因素共同作用的結果，如：患者背景（遺傳、預存狀態）、藥物（結構、尺寸、序列以及雜質、制劑等）、治療方式（給藥方式、頻次、持續時間等）因素均對免疫原性的形成有影響。美國藥典通則1106對這些影響因素進行整理，主要可以分為3個方面。
表1 影響免疫原性產生的因素
2.1 患者相關因素
每個人的免疫狀態都存在差別，而主要組織相容性和人類白細胞抗原（HLA）等位基因的差異與個體的免疫反應密切相關。如攜帶HLA-DRb-11, HLA-DQ-03, HLA-DQ-05等位基因的患者一般更容易產生免疫原性。
患者免疫系統的激活狀態也與免疫原性的發生有關。自身免疫性疾病患者的免疫系統處于激活狀態，一般易于產生免疫原性，而腫瘤患者的免疫系統一般處于抑制狀態，不易產生免疫原性。
是否有相關藥物接觸史也影響著免疫原性的發生，如PEG在化妝美容類產品中廣泛存在，患者可能經常接觸含PEG的相關產品而存在針對PEG的預存抗體。
2.2 藥物相關因素
藥物結構
治療性蛋白被機體的免疫系統當做外源物，藥物藥效的發揮通常由其結構上表位序列的完整性決定，藥物的氧化、脫酰胺、脫氨基、降解、構象等結構變化和序列差異都被認為是引起免疫原性的風險因素，因為它們能夠改變蛋白的構象、加劇藥物的聚集或者改變抗原攝取的動力學、加工和呈遞抗原肽。上述藥物的化學變化類似于生物轉化，可能發生在受損的生理環境中，如炎癥組織。重組內源性蛋白藥物若發生結構的改變也會打破免疫耐受，導致ADA的產生。
治療性蛋白結構中的糖基化也會影響藥物的免疫原性。治療性蛋白的翻譯后修飾由所選擇產品的表達系統或者細胞系所決定。目前大部分在研產品或已上市產品均采用中國倉鼠卵巢細胞系（Chinese hamster ovary cell lines, CHO）。與其它如酵母、昆蟲細胞系不同，采用哺乳動物細胞系獲得的產品所具有的糖基結構被認為與天然的人糖基結構更為接近。保持與人相同的糖基化修飾對于重組人蛋白治療藥物尤為重要。糖基類型不但影響治療性蛋白的功能，也會影響產品的穩定性、蛋白的折疊情況以及生物物理學特征的優化。所以，在生產過程中需要檢測糖基化結構。但某些糖基化結構雖具有抗原性，但聚集性降低、且封閉免疫原性表位的情況也時有發生。
聚體
聚體用來描述治療性蛋白多聚物的形成，既可以在溶解在溶液中，也可以形成不溶性顆粒。治療性蛋白最理想的情況是以其最小的天然均勻分散的形式存在。然而，它們通常會形成小到二聚體結構大到在顯微鏡下可見的顆粒。并且，從化學結構的修飾到環境因素如儲存問題、濃度、pH、離子強度、凍融和機械鍛煉等多種多樣的因素都會影響治療性蛋白的存在狀態。盡管聚集具有較高的免疫原性風險，但是其與免疫系統的相互作用機制，以及它們的大小、數目、結構、數量的影響皆不明，有待于進一步研究。
雜質
雜質是另一重要因素，具有佐劑特征。若存在于終產品中，即使在治療性蛋白藥物本身不產生經典的免疫原性情況下，雜質也可能會引起免疫原性。這些雜質可能來源于宿主細胞成份、色譜柱上的樹脂、酶、內毒素、細菌DNA、以及用于純化的單抗都可能殘留在終產品中。它們能夠激活模式識別受體（pattern recognition receptors, PRR），產生促炎性細胞因子，增加APC對抗原的加工和呈遞。需要強調的是，由污染物所引起的非特異的免疫反應能夠作為共刺激因素，打破免疫耐受，使機體產生ADA發生率增加，且增加滴度水平。但也有研究表明，在一些單抗產品中宿主細胞水平較高，卻沒有增加免疫原性的產生。由雜質產生的免疫反應一般為皮膚反應、過敏反應、以及血清學疾病等。隨著哺乳動物細胞系的應用，以及純化技術和其它下游工藝水平的提高，微生物相關的污染可以被控制到最低水平。這是藥物研發的關鍵環節，比如宿主細胞蛋白就是生產不同階段常規的監測指標。
其它
穩定劑的成分也尤為關鍵，典型的例子是Epogen制劑的蛋白穩定劑由人血清白蛋白變為PS80（聚山梨酯）后產生ADA，引起了嚴重純紅細胞再生障礙副作用。
與容器的相互作用，或者與在灌封系統中遇到的各部分相互作用可能會產生蛋白結構的改變而產生免疫原性。與玻璃器皿或者空氣相互作用可能會使蛋白發生變性，引起蛋白的聚集，可能產生免疫原性。所以，為了避免免疫原性的產生應選擇不會致使蛋白藥物聚集的材質作為容器。
2.3 治療相關因素
給藥途徑
給藥途徑可以影響免疫原性。由于皮下給藥可能易被DCs攝取和加工，使其比靜脈給藥容易產生免疫原性；但有研究發現，16個非免疫調節劑皮下給藥，ADA的發生率＜15%。粘膜給藥和肺部給藥途徑也會產生免疫原性。通常高劑量藥物產生的免疫原性低，但數據解讀時應該注意，可能由于高劑量組在循環中存在高濃度藥物干擾檢測或者抗藥抗體水平會隨著免疫復合物的增加而降低所致。
給藥頻次
重復給藥或間歇給藥比一次性使用的單克隆抗體誘導免疫原性的可能性更高。
免疫原性產生的臨床風險
之所以要關注免疫原性，是因為一旦治療性蛋白發生了免疫反應，就有可能帶來風險，輕則影響藥物療效，重則危及患者生命。在免疫原性無法避免的情況下，充分認識免疫原性可能產生的風險，及時進行監測產生免疫原性反應并及早進行干預就尤為重要。美國藥典通則1106對產生免疫原性后可能的臨床風險進行了匯總。
表2 影響免疫原性的臨床后果的因素
從臨床表現來看，產生免疫原性后可能對患者無明顯影響，可能影響藥物的藥代或藥效，也可能帶來額外的安全性問題。FDA在2016年總結并發表了其當時批準的121個生物制品，其中89%均發生免疫原性反應，其中有49%影響藥效，60%有安全性相關問題。
圖3 上市藥物免疫原性發生率及臨床影響統計分析
免疫原性評價策略
基于治療性蛋白引起機體產生免疫反應后可能帶來的有效性和安全性問題，有必要對治療性蛋白的免疫原性進行評估與監測。
免疫原性的評估可以從完全理論上的模擬計算，到臨床前體內外實驗預測，再到臨床給藥后直接監測受試者的免疫反應。
計算機模擬計算主要基于T細胞表位預測來評價生物藥物的免疫原性。各種T細胞表位預測的工具很多，FDA總結開發了TCPro預測工具，用于T細胞表位預測輔助進行免疫原性評估。
圖4 TCPro工作流程圖
免疫原性體外實驗主要通過檢測免疫細胞激活釋放的細胞因子來進行評價。MHC II抗原結合也是一種可選的體外免疫原性評價方法。
最能反應藥物免疫原性的方法是觀察給藥后免疫系統的反應。在進行人體給藥之前，轉基因動物和非人靈長類動物的免疫反應與人最為相似，是目前應該較多的免疫原性體內分析的模型。各種臨床前免疫原性評價方法的優缺點匯總如下。
表3 臨床前免疫原性評價工具
臨床前各種預測免疫原性的方法雖然能夠提供較多的信息，但與臨床受試者真實免疫反應的相關性還沒有形成業界共識，直接檢測臨床受試者血清中的抗藥抗體仍然是目前公認的免疫原性評價方法，也是各國藥監局的監管要求。目前FDA，USP，EMA，NMPA普遍推薦通過抗藥抗體的檢測來評價治療性蛋白的免疫原性。而對抗藥抗體檢測也同其它定量檢測有所差別，而是基于層級遞進的分析策略綜合評價抗藥抗體的產生。目前業界公認的分析層級包括篩選-確證-鑒別三個層級，而在第三個分析層級-鑒別層級中，目前研究較多是滴度分析和中和抗體分析。
圖5 免疫原性評價策略
篩選實驗是整個層級分析的開始，應盡可能檢測出全部的潛在陽性樣本，可以允許存在一定的假陽性樣本（一般為5%）。篩選實驗的結果判斷是基于統計的判定方式，使用藥物未暴露人群的血清作為參考設置陽性樣品判定的cut-off值，將高于cut-off值的樣品判斷為陽性。
由于篩選實驗天然有5%的假陽性樣品，在篩選實驗得到的陽性樣品需進一步進行確證。確證實驗一般采用同篩選實驗相同的檢測方法，在樣品檢測過程中加入一定量的藥物競爭結合抗藥抗體。如存在抗藥抗體，則檢測信號明顯下降。為提高陽性樣本的可信度，確證實驗的假陽性率一般設置在1%。
經過篩選和確證得到的陽性樣本即為抗藥抗體陽性樣本，根據研究需要可對抗藥抗體的濃度水平進行半定量檢測-滴度實驗。滴度實驗與篩選實驗使用相同的檢測方法，以樣品檢測值高于cut-off值的最大稀釋倍數作為樣品的滴度。
另外為了評估產生的抗藥抗體是否影響藥物的生物學活性，需要進行中和抗體檢測。中和抗體的檢測方法必須基于藥物的作用機制進行設計。
抗藥抗體檢測方法
免疫原性研究主要聚焦在抗藥抗體的檢測和表征上，應獲得抗藥抗體的發生率、滴度、存續時間和中和能力數據。
抗藥抗體的檢測可以使用多種生物分析平臺來完成，包括ELISA（ Enzyme-linked immunosorbent assay）、ECL（Electrochemiluminescence）、RIA（Radioimmunoassay）、 SPR（Surface plasmon resonance）。此外，用于篩選和確認ADAs的免疫測定可以使用多種形式和檢測系統進行，每種方法都有各自的優缺點。
圖6 各種抗藥抗體檢測平臺的原理
此外，人類ADA是復雜的分析物，它們通常是多克隆的，與不同區域結合，具有不同的同型和結合親和力，因此對ADA分析方法的選擇上要盡量針對其特異性的結合區域來選擇，以充分評估藥物的真實免疫原性。
在分析平臺的選擇上，可以考慮下表中所列的各平臺的分析方法的優缺點，規避可能出現的假陰性。
表4 各種抗藥抗體檢測平臺的優缺點
中和抗體檢測一般基于藥物的作用機制進行設計，USP1106對常見的藥物作用機制進行了分類，并給出了推薦的方法選擇，為了更全面的反應藥物的作用機制，一般中和抗體檢測選擇基于細胞的分析方法平臺。
圖7 治療性蛋白分類及適用方法
FDA在2018年統計了當時近五年的申報方法，其中ADA的檢測以ECL和ELISA平臺為主，中和抗體檢測以細胞實驗和競爭配體結合實驗平臺為主。
圖8 FDA近五年申報的治療性蛋白檢測方法統計
案例分析
一種在研抗體類項目的臨床實驗入組了60例患者，每例患者共采集6個時間點（包括給藥前）的血清樣本用于抗藥抗體檢測。
首先通過篩選實驗，得出有6位患者的9份樣本結果為陽性。通過進一步的確證實驗確定其中3份為假陽性，另外3位患者的6份血清為ADA陽性。
表5篩選實驗結果匯總
注：-：篩選實驗陰性；±：篩選實驗陽性，確證實驗陰性；+：篩選實驗陽性，確證實驗陽性。
通過titer實驗來表征抗藥抗體的相對含量，結果顯示6份樣品的滴度從160-1280不等。
圖9 ADA陽性樣品滴度分析結果
進一步研究產生的抗藥抗體是否影響藥物的藥效，建立了活性抑制中和抗體檢測實驗， 6份ADA陽性樣本均具有中和活性，能阻斷藥物的活性。
結語
免疫原性分析在治療性蛋白藥物的研究和開發中關注度越來越高，而臨床試驗中對于抗藥抗體的檢測更是成為了藥監局的監管要求。免疫原性研究貫穿了整個藥物研究的生命周期，且已經成為藥監局和醫藥研究領域的共識。為了開發出更具競爭力的蛋白類藥物，研究人員已經將免疫原性的研究前移，從藥物設計階段就通過各種技術降低藥物的免疫原性，提高藥物研究成功率。同時，開發和建立可靠的非臨床免疫原性分析評估方法也對臨床免疫原性提供早期的指導。相信隨著臨床抗藥抗體分析為核心的免疫原性分析策略的進一步推廣，以及對細胞免疫監測分析方法進一步完善，勢必會更加全面、深入地推動藥物研發進程。
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來源：新浪醫藥。
