牛奶含有人體必需的南京微量營養素，對人們平衡膳食至關重要。工業高兵然而，大學打印乳糖不耐癥患者在攝入含有乳糖的何冰牛奶后，由于腸道中缺乏水解乳糖的芳教乳糖酶，會出現腹脹、授和腹瀉和腸胃痙攣。兵副盡管現在食品工業通過膜分離、教授超濾和添加游離β-半乳糖苷酶等方法實現了低乳糖和無乳糖牛奶的團隊生產，然而生產工藝復雜和生產過程中資源浪費導致其低成本效益。最新其中β-半乳糖苷酶將乳糖分水解為葡萄糖和半乳糖，南京高效水解牛奶乳糖的工業高兵同時不影響牛奶的營養價值。因此，大學打印一種高效，何冰操作穩定和安全的芳教 β-半乳糖苷酶固定化方法用于低乳糖和無乳糖牛奶的生產具有重要意義。
為了實現這一目標，南京工業大學何冰芳教授團隊開發出一種3D打印β-半乳糖苷酶流動反應器用于低乳糖和無乳糖牛奶的生產（圖1）。通過聚乙烯亞胺和透明質酸鈉層的層層自組裝快速修飾3D打印聚乳酸支架簡化酶固定化載體修飾過程，京尼平作為交聯劑共價固定了β-Gal保證高效、穩定地固定酶（固定效率為 92.87%）。此外，集成到流動反應器中的3D打印支架通過定向通道擾動了不同反應器中的流體，改善了內部傳質，從而實現了高催化活性（乳糖水解效率為 94.20%）。在β-Gal流動反應器中反應 6 小時和 12 小時的牛奶乳糖殘留量分別為 1.87 g dL-1和 0.38 g dL-1，完全符合食品安全國家標準對低乳糖和無乳糖牛奶的要求。該反應器酶固定化效率高，催化活性穩定，在低乳糖和無乳糖牛奶生產及其他生物催化領域具有廣闊的應用前景。
圖1 用于高效低乳糖和無乳糖牛奶生產的3D打印β-半乳糖苷酶流動反應器
在本研究中，研究人員制作內部具有定向通道和孔隙的3D打印聚乳酸支架（圖2）。與傳統的酶固定化載體如微納米粒子、水凝膠等相比，3D打印支架可以更簡便的和流動反應器相結合而不用考慮管道堵塞和壓實的問題。此外，聚乙烯亞胺和透明質酸鈉層層自組裝修飾3D打印支架簡化酶固定化載體修飾過程。
圖2 3D聚乳酸支架以及聚乙烯亞胺和透明質酸鈉層層自組裝修飾過程
此外，京尼平作為一種交聯劑，目前已被廣泛研究用于高效共價連接酶分子和改性載體支架，更重要的是，它的細胞毒性比傳統交聯劑戊二醛低 5,000-10,000 倍。在酸性條件下，β-半乳糖苷酶的伯氨基進攻京尼平的 C3，打開二氫吡喃環，形成芳香族氨基。研究人員通過條件優化實現了β-半乳糖苷酶的高效固定和穩定的固定化酶性質（圖3）。
圖3 固定化條件優化和固定化酶學性質研究
同時，研究人員將3D打印β-半乳糖苷酶支架和流動反應器相結合，通過設計不同的支架內部結構研究流體擾動對于酶和底物傳質影響。此外，還通過COMSOL模擬進一步研究流體在反應器內部分布。集成到流動反應器中的3D打印支架通過定向通道擾動了不同反應器中的流體，改善了內部傳質，從而實現了高催化活性（牛奶乳糖水解效率為 94.20%）（圖4）。
圖4 3D打印β-半乳糖苷酶流動反應器的乳糖水解性能
以上成果以題目“Sustainable 3D-printed β-galactosidase Immobilization Coupled with Continuous-flow Reactor for Efficient Lactose-free Milk Production”發表在國際頂級期刊Chemical Engineering Journal雜志上（影響因子15.1）（論文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cej.2024.148557）。論文第一作者為南京工業大學藥學院碩士研究生邵云，通訊作者為南京工業大學藥學院的何冰芳教授以及高兵兵副教授。研究工作得到了國家重點研發計劃、國家自然科學基金、江蘇省自然科學基金等項目的資助。
