別離純化是重組基因工程藥物生產(chǎn)中極其重要的一環(huán), 這是因?yàn)楣こ叹ㄟ^大規(guī)模培育后, 產(chǎn)生的有效成分含量很低, 雜質(zhì)含量卻很高; 另外因?yàn)榛蚬こ趟幬锸菑霓D(zhuǎn)化細(xì)胞, 而不是從正常細(xì)胞生產(chǎn)的, 所以對(duì)產(chǎn)品的純度要求也高于傳統(tǒng)產(chǎn)品。所以要得到合乎醫(yī)用要求的人胰基因工程藥物, 分離純化要比傳統(tǒng)產(chǎn)品困苦得多。在重組人胰島素(Recom b inan t hum anin su lin, rh I) 的島素的制基因工程生產(chǎn)中, 同樣面臨著下游解決十分復(fù)雜的問題。為了能有效地純化目的備下產(chǎn)物, 眼前基因工程生產(chǎn)中廣泛運(yùn)用的是親合層析和HPLC等手段, 這些分離純化技術(shù)盡管區(qū)分率高, 特異性強(qiáng), 但十分昂貴。不利于降低成本。游純藝的研究為了降低生產(chǎn)成本, 本鉆研設(shè)立了一套由(H is) 62A rg2A rg2人胰島素原[ (H is) 62A rg2A rg2 hum an p ro in su lin, RRhP I ] 制備重組人胰島素的化工下游純化工藝, 并對(duì)產(chǎn)品的性質(zhì)和純度進(jìn)行了鑒定。
以包涵體方式表述的重組RRhP I 因?yàn)槎蜴I配對(duì)謬誤, 水溶性很差, 在進(jìn)行DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析時(shí), 為了增加RRhP I 的溶解度, 緩沖液中加入了斤斤計(jì)較的脲素, 此時(shí)RRhP I 處于變性環(huán)境中。因此, 在雙酶切轉(zhuǎn)化之前必須首先除去尿素, 使RRhP I 復(fù)性。人胰本鉆研用Sephadex G225 層析去除變性劑, 可有效避免蛋白的島素的制匯集, 并誘導(dǎo)變性蛋白R(shí)RhP I 向其天然態(tài)折疊。在咱們所采用的備下條件下進(jìn)行層析, 得到2 個(gè)層析峰, 峰2 為折疊趨于正確的單體RRhP I。其中的游純藝的研究高分之量雜蛋白有所縮小。峰1為高分子量雜蛋白、化工多聚RRhP I 及折疊不完全或不正確的重組RRhP I。對(duì)這一部分進(jìn)行再層析和折疊反應(yīng), 能夠提升折疊的人胰總收率。由此可見, 此步層析可達(dá)到純化, 去除變性劑和誘導(dǎo)復(fù)性的島素的制三重成效。在體內(nèi), 參與胰島素原轉(zhuǎn)化過程的有兩種Ca2+依賴的內(nèi)肽酶以及羧肽酶H。在體外, 用胰蛋白酶和羧肽酶B 協(xié)同酶切同樣可將胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素[ 4, 5 ] , 這使得通過E. co li 表述人胰島素原制備人胰島素成為可能。在本鉆研建立的表述產(chǎn)物中, 引導(dǎo)肽(H is) 6 與胰島素原之間插入了兩個(gè)A rg, 這與C肽和胰島素之間銜接的方式是相同的, 因此在雙酶切轉(zhuǎn)化的同時(shí), (H is) 62A rg2A rg 能夠被準(zhǔn)確去掉,無須另外采用其它的解決方式, 從而減化了后解決過程。在本鉆研所選用的酶切條件下, RRhP I 被準(zhǔn)有因效地轉(zhuǎn)變成了h I。SDS2PA GE 剖析顯示, 酶切較完全, 主角電泳條帶從13 KD 鄰近轉(zhuǎn)移到了與人胰島素標(biāo)準(zhǔn)品平行的位置。
眼前人們廣泛使用制備型HPLC 進(jìn)行基因工程產(chǎn)物的最后青云純化[ 6～ 8 ]。這是因?yàn)镠PLC 具備操作方便快捷, 分辨率高, 產(chǎn)品純度能一次性達(dá)到臨床要求等長處。然而HPLC 具備對(duì)軟硬件的要求較高, 前期投入大, 純化量有限等等缺點(diǎn), 從而使生產(chǎn)能力受到影響。本鉆研在最后純化制備人胰島素時(shí)選用的Superdex 75 分子篩層析, 其具備機(jī)械強(qiáng)度高, 穩(wěn)定性好, 重現(xiàn)性好, 粒度小(24～ 44L) , 分辨率高(13 000 p lates?m ) , 流速快(0. 85～ 4. 4 m l?m in, 25℃) , 且可在低壓下操作, pH 范疇廣(3～12) , 分離范圍廣(球形蛋白, 3～ 70KD ) , 非特異性吸附小, 負(fù)載量大, 層析條件易控制等等優(yōu)點(diǎn), 是一個(gè)非常理想的純化基因工程產(chǎn)品的層析辦法。用0.2 mo l?L 乙酸鈉2乙酸, pH4. 0 的緩沖液作均衡液和
洗脫液, 將h I 粗品通過Superdex 75 柱層析后, 咱們得到了純度較高的人胰島素制品, SDS2PA GE 剖析樣品只要一條帶。眼前尚未見采用Superdex 75純化基因工程產(chǎn)品的有關(guān)報(bào)道。胰島素是天然生物活性物質(zhì), 必須保持天然的二級(jí)結(jié)構(gòu)才能小題大作降血糖的生物活性。小鼠驚厥試驗(yàn)的陽性結(jié)果充分表明, 本鉆研所抉擇的層析條件不但有效地純化了表述產(chǎn)物, 而且有效地防止了目標(biāo)產(chǎn)物h I 的失活變性, 本鉆研最終制備了純度較高的具備天然活性的基因工程人胰島素。
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