【研究背景與研究進展】

CRISPR/CRISPR相關(guān)酶(Cas13a)可以在靶向識別后可通過“附帶效應(yīng)”對腫瘤細胞進行選擇性殺傷，雙鎖這使得其在腫瘤治療中具有廣闊的納米應(yīng)用前景。然而，粒擾亂這種“附帶效應(yīng)”并不特別針對腫瘤細胞，雙鎖當(dāng)在全身給藥時可能會引起安全問題。納米近日，粒擾亂南開大學(xué)劉陽教授，雙鎖史林啟教授和天津醫(yī)科大學(xué)康春生教授（共同通訊作者）在國際著名期刊Adv. Mater.上發(fā)表相關(guān)研究文章，納米題目為“Dual-Locking Nanoparticles Disrupt the PD-1/PD-L1 Pathway for Efficient Cancer Immunotherapy”。粒擾亂

該研究描述了一種可限制CRISPR/Cas13a對腫瘤組織特異性激活的雙鎖雙鎖納米顆粒（DLNP）。DLNP具有核-殼結(jié)構(gòu)，納米其中CRISPR/Cas13a系統(tǒng)（質(zhì)粒DNA，粒擾亂pDNA）被具有雙響應(yīng)聚合物殼層包裹在核內(nèi)。雙鎖該聚合物層賦予DLNP在血液循環(huán)或正常組織中增強的納米穩(wěn)定性，并促進CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的粒擾亂細胞內(nèi)化和進入腫瘤組織時基因編輯的激活。在仔細篩選和優(yōu)化以程序性死亡配體1(PD-L1)為靶點的CRISPR RNA(crRNA)序列后，DLNP顯示了對B16F10荷瘤小鼠T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的有效激活和免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）的重塑，從而顯著抑制了腫瘤的生長，提高了荷瘤小鼠的生存率。

【圖文簡介】

圖1 DLNP在有效腫瘤免疫治療中的示意圖

類似于僅在兩個鎖都解鎖時才能打開的雙鎖保險箱，DLNP只能在低pHe和高H₂O₂濃度同時存在的微環(huán)境中釋放CRISPR / Cas13a系統(tǒng)。用這種基于CRISPR/Cas13a的PD-1/PD-L1通路靶向劑，DLNP有效地指導(dǎo)了T細胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答，并對免疫抑制的TME進行了重塑，使抗腫瘤效果和生存率顯著提高，且對小鼠的副作用極小。

圖2 DLNP、H₂O₂-NP和pH-NP的結(jié)構(gòu)表征

a）雙鎖定納米顆粒（DLNP）的合成示意圖；

b）DLNP的尺寸分布和TEM圖像。標(biāo)尺為200納米；

c）不同條件下DLNP、H₂O₂-NP和pH-NP的Zeta電位；

d）在37°C的FBS溶液中培養(yǎng)30分鐘后，DLNP、H₂O₂-NP和pH-NP的非特異性蛋白質(zhì)吸附量；

e）不同條件下培養(yǎng)后DLNP的熒光光譜。PEI-PBA和PEI-HPBA用Cy5預(yù)標(biāo)記；mPEG-b-PLys-SGD/CA和mPEG-b-PLys-SGD/SA用Cy3預(yù)標(biāo)記。在515nm的激發(fā)波長下記錄光譜；

f）流式細胞儀定量分析DLNP，H₂O₂-NP和pH-NP的細胞內(nèi)在化程度；

g）將DLNP（a），H2O2-NP（b）和pH-NP（c）在不同條件下與膠質(zhì)瘤細胞共培養(yǎng)2 h的熒光顯微鏡圖片。細胞骨架F-肌動蛋白和細胞核分別用若丹明鬼筆環(huán)肽（橙色）和4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（藍色）復(fù)染色。 標(biāo)尺為40 μm；

h）在含有0％或10％血清的培養(yǎng)基中，不同條件下用DLNP，H₂O₂-NP和pH-NP轉(zhuǎn)染的U87MG細胞的熒光顯微鏡圖像。

圖3 DLNP、H₂O₂-NP和pH-NP的生物功能表征

a–c）在不同條件下用DLNP處理的B16F10（a），GL261（b）和4T1（c）細胞的RNA變性凝膠。DLNP負載Cas13a/PD-L1；

d, e）在不同條件下用DLNP處理的B16F10（a），GL261和4T1（b）的細胞存活率。

圖4 DLNP的體內(nèi)抗腫瘤作用

a-c）PBS，Null，PEI_25k/pDNA，pH-NP，H₂O₂-NP和DLNP處理的小鼠的平均腫瘤生長動力學(xué)a），荷瘤小鼠的存活率b），以及小鼠的體重變化c）（n = 6）；

d-f）PBS，Null，PEI_25k/pDNA，pH-NP，H₂O₂-NP和DLNP處理的小鼠的腫瘤中腫瘤內(nèi)的TNF-α（a），IFN-γ（b）和IL-2（c）水平；

g）PBS，Null，PEI_25k，pH-NP，H₂O₂-NP和DLNP處理的小鼠體內(nèi)腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞的流式細胞統(tǒng)計分析；

h）PBS，Null，PEI_25k，pH-NP，H₂O₂-NP和DLNP處理的小鼠體內(nèi)腫瘤內(nèi)CD8+ T細胞和CD4+ T細胞的流式細胞儀圖；

i）腫瘤的代表性免疫熒光圖像顯示CD8+ T細胞和CD4+ T細胞浸潤。標(biāo)尺為100 μm。

圖5 TME中DLNP的免疫反應(yīng)分析

a，d）PBS，Null，PEI_25k，pH-NP，H₂O₂-NP和DLNP處理的小鼠體內(nèi)腫瘤內(nèi)M2細胞的流式細胞儀圖a），和統(tǒng)計結(jié)果d）；

b，e）PBS，Null，PEI_25k，pH-NP，H₂O₂-NP和DLNP處理的小鼠體內(nèi)腫瘤內(nèi)M1細胞的流式細胞儀圖b），和統(tǒng)計結(jié)果e）；

c，f）PBS，Null，PEI_25k，pH-NP，H₂O₂-NP和DLNP處理的小鼠體內(nèi)腫瘤內(nèi)髓系抑制細胞的流式細胞儀圖c），和統(tǒng)計結(jié)果f）；

g）PBS，Null，PEI_25k/pDNA，pH-NP，H₂O₂-NP和DLNP處理的小鼠的腫瘤中腫瘤內(nèi)的IL-12水平。

圖6 DLNP對CD8+T細胞缺失的B16F10荷瘤小鼠和4T1/B16F10共荷瘤小鼠體內(nèi)抗腫瘤作用的研究

a-d） DLNP處理的正常荷瘤小鼠及CD8+阻斷荷瘤小鼠的平均腫瘤生長動力學(xué)a），存活率b），以及小鼠的體重變化d）；

c）腫瘤的代表性免疫熒光圖像顯示CD8 + T細胞和CD4 + T細胞浸潤。 比例尺為100 μm;

e）4T1（右）和B16F10（左）共育C57BL/6小鼠示意圖；

f）共負載小鼠的腫瘤生長曲線；

g）分別用PBS和DLNP處理的小鼠4T1和B16F10腫瘤中CD8+T細胞和CD4+T細胞的代表性流式細胞儀圖。

【小結(jié)】

該研究開發(fā)了一種雙鎖納米粒子，它可以限制CRISPR/Cas13a在腫瘤組織中的激活。采用聚乙二醇（PEG）為基的聚合物外殼，經(jīng)靜脈注射后，DLNP具有良好的血液循環(huán)穩(wěn)定性。更重要的是，DLNP只能在低ph和高H₂O₂濃度的微環(huán)境中釋放CRISPR/Cas13a系統(tǒng)。這一特性顯著改善了CRISPR/Cas13a系統(tǒng)在腫瘤部位的富集，提高了CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的基因編輯效率，減少了CRISPR/Cas13a在正常組織中的意外激活所引起的副作用。通過DLNP對CRISPR/Cas13a活化的精確控制，首次實現(xiàn)了CRISPR/Cas13a系統(tǒng)在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。

全身給藥DLNP/Cas13a/PD-L1后，B16F10荷瘤小鼠的腫瘤生長速率顯著減緩，生存率明顯提高。因此，我們的研究為精確控制CRISPR/Cas13a系統(tǒng)激活抑制腫瘤生長提供了一種安全有效的方法?？紤]到免疫效應(yīng)細胞抑制途徑的多樣性，可以通過替換特異性crRNA的靶向基因而進行的進一步開發(fā)可能使DLNP成為快速開發(fā)安全有效的癌癥免疫療法的通用平臺。

文獻鏈接：Dual-Locking Nanoparticles Disrupt the PD-1/PD-L1 Pathway for Efficient Cancer Immunotherapy, 2019, Adv. Mater. DOI: 10.1002/adma.201905751.

團隊介紹：

劉陽博士，研究員，2006年畢業(yè)于南開大學(xué)化學(xué)專業(yè)，獲學(xué)士學(xué)位。同年考入南開大學(xué)高分子化學(xué)研究所，2011年畢業(yè)，獲高分子化學(xué)博士學(xué)位。畢業(yè)后赴美在加州大學(xué)洛杉磯分校化學(xué)工程與分子生物工程系深造，于2016年獲化學(xué)工程博士學(xué)位。主要從事高分子納米藥物載體及生物活性納米材料的研究。代表性研究成果包括：建立了納米復(fù)合酶的可控構(gòu)建方法，實現(xiàn)了多種蛋白體內(nèi)和胞內(nèi)的協(xié)同遞送；建立了多種可動態(tài)適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境的納米載體，顯著提升了藥物對腫瘤的富集效率；提出通過納米-生物界面相互作用直接干預(yù)生物過程的新思路，構(gòu)建多種具有生物活性表面的納米顆粒，為癌癥免疫治療及阿爾茲海默癥的治療提供了全新的思路。相關(guān)成果在Nat. Nanotechnol. (1), Adv. Mater. (3), Nat. Commun. (1), Angew. Chem. Int. Ed. (2), Nano Lett. (2), Adv. Sci. (1) 等期刊發(fā)表論文40余篇。2016年入選中組部“青年千人”，2018年以首席科學(xué)家身份承擔(dān)科技部重點研發(fā)計劃“納米科技”青年項目。

推薦文獻：

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