來源：醫藥魔方Pro

PROTACs全稱為Proteolysis-Targeting Chimeras，變即蛋白水解靶向嵌合體，分膠是降解劑竟能降解一種不同于抗體和傳統小分子抑制劑的新藥物類型，由3部分組成：靶蛋白binder、變linker以及E3泛素連接酶binder。分膠也就是降解劑竟能降解說，PROTAC分子的變一端與靶蛋白結合，另一端與E3泛素連接酶結合。分膠而E3泛素連接酶可通過將一種叫做泛素的降解劑竟能降解小蛋白貼在靶蛋白上將其標記為缺陷或受損蛋白。之后，變細胞的分膠蛋白粉碎機（即，蛋白酶體）會識別和降解被標記的降解劑竟能降解靶蛋白。

近幾年，變作為調節蛋白穩態的分膠一種新方式，PROTAC受到了學術界和工業界的降解劑竟能降解廣泛關注，很多團隊正在積極開發基于PROTAC技術的蛋白降解劑。靶蛋白方面，有統計稱，目前PROTAC針對的熱門靶點有100多個，進展最快的包括AR-PROTAC、ER-PROTAC、BTK-PROTAC等；E3泛素連接酶方面，目前最常被用于PROTAC開發的有兩種，分別是Von Hippel Lindau (VHL)和cereblon (CRBN)。其中，CRBN也是另一類在研蛋白降解劑——分子膠經過驗證的靶點。

CRBN是CRL4 E3泛素連接酶的一部分，作為底物受體（substrate receptor, SRs）識別底物蛋白，從而啟動降解過程。CRLs是E3泛素連接酶中最大的一個家族，通過將底物受體和適配器蛋白圍繞不同的cullin骨架進行組裝，形成了超過250種CRLs。

簡單來說，分子膠降解劑是一類可誘導E3泛素連接酶底物受體（如CRBN）與靶蛋白之間新型相互作用，從而導致靶蛋白降解的小分子。沙利度胺、來那度胺和泊馬度胺類小分子免疫調節劑是分子膠的一個顯著例子，可重定向CRBN，從而使轉錄因子IKZF1和IKZF3多聚泛素化，導致IKZF1和IKZF3被蛋白酶體降解。類似地，抗癌磺胺類藥物indisulam也可引導E3泛素連接酶DCAF15與RBM39之間的相互作用，促進RBM39的降解。總之，分子膠以及PROTAC技術的發展為靶向致病蛋白，包括許多利用傳統的方法很難靶向的蛋白，提供了新策略。

4月4日，來自威斯康星大學麥迪遜分校的一個科學家小組在發表于European Journal of Medicinal Chemistry雜志上的一篇論文中公布了他們所開發的一款新型MDM2降解劑[1]。

MDM2，全稱為雙微體同源基因2（mouse double minute 2），是p53（一種強大的腫瘤抑制因子，人類癌癥中突變最頻繁的基因）的關鍵負調節因子，在腫瘤中高表達，對腫瘤的發生和發展起到重要的作用。先前的研究表明，MDM2不僅可與p53結合，以阻斷其腫瘤抑制反式激活域，該蛋白本身還是一種E3連接酶，可標記p53，使其被蛋白酶體降解。由于約50%的人類癌癥中保留著野生型p53基因，只是這些p53的腫瘤抑制功能被MDM2等信號分子削弱了，因此研究者們希望，通過開發小分子抑制劑或降解劑來阻斷p53與MDM2之間的相互作用，攜帶野生型p53的患者能夠恢復p53的抑癌活性。

在2019年8月，該科學家團隊曾報道，他們開發了一款高效的MDM2-PROTAC——WB156[2]，WB156由nutlin衍生物和CRBN配體來那度胺連接而成（下圖A；nutlin是最早被發現可以抑制p53–MDM2相互作用的小分子抑制劑）。在白血病細胞中，WB156能夠有效耗盡MDM2，激活野生型p53，進而誘導細胞凋亡。不過，盡管WB156能夠有效降解MDM2，誘導p53激活，顯示抗增殖作用，但該分子只能在有限數量的白血病細胞系中起作用。

MDM2降解劑的設計。(A)MDM2降解劑WB156的結構、Ugi反應ligand1和ligand2；(B) Ugi配體與MDM2結合位點結合的共結晶結構；(C)從Ugi反應衍生配體和來那度胺衍生物構建MDM2降解劑的策略。（來源：European Journal of Medicinal Chemistry）

為了克服這一瓶頸，科學家們設想，融合不同的MDM2配體可能能夠使MDM2降解劑在更廣泛的癌癥中起作用。在最新發表的這項新研究中，他們首先利用“MDM2 ligand 1”和“MDM2 ligand 2”（上圖A）進行四組分Ugi反應制備了用于開發MDM2降解劑的配體，然后用這些配體作為MDM2的binder來構建活性MDM2降解劑。經過廣泛的優化，WB214被鑒定為在各種白血病細胞系中最有效的抗增殖藥物。

令人驚訝的是，機制研究表明，這種新型WB214降解劑并沒有激活p53，相反的，WB214誘導了p53的降解，這與該團隊先前報道的MDM2降解劑WB156完全相反。

科學家們進行了一系列實驗來調查導致這種效應背后的潛在作用機制。結果顯示，1)WB214介導的MDM2-p53復合物降解是通過泛素-蛋白酶體系統實現的；2) p53在MDM2降解過程中是一個旁觀者，因為它與MDM2直接相關，因此產生了“旁觀者降解效應”；3) WB214-CRBN復合物不在p53結合位點與MDM2結合（相比之下，MDM2 ligand 1或WB13均在p53結合位點與MDM2結合）。

由于三元復合物的形成是蛋白酶體降解的前提，因此，研究者們進一步分析了WB214誘導三元復合物形成的情況，并證實WB214能夠以劑量依賴性的方式有效誘導三元復合物的形成，且相比WB156，WB214誘導了更強的CRBN-MDM2相互作用(下圖D)。這些數據表明，與WB156(真正的MDM2 PROTAC)不同，WB214并不是通過經典的PROTAC機制降解MDM2。WB214的作用機制與分子膠更一致。換句話說，WB214只是通過與其CRBN相互作用導致與MDM2結合。作者們稱，這是首次發現MDM2可以作為CRBN的新底物（neo-substrate）。

接著，研究揭示，WB214降解p53后依然能夠抑制白血病細胞生長是因為，這款降解劑還能夠有效降解GSPT1。GSPT1全稱為G1 to S phase transition 1，也被稱為eRF3a，通過與釋放因子eRF1相互作用，介導終止密碼子識別和新生蛋白從核糖體釋放。先前有研究顯示，GSPT1作為CRBN的新底物（neo-substrate），可被CC-885或ZXH1-161(來那度胺衍生物)有效降解，導致白血病細胞增殖被顯著抑制。也有報道稱，GSPT1是招募CRBN的PTOTAC分子產生脫靶效應的一種原因，例如Crews教授及其同事發現，基于沙利度胺的c-Met PROTAC分子誘導GSPT1降解。此外，也有團隊通過對MDM2 PROTAC分子的簡單結構修飾意外發現了可降解GSPT1的分子膠（MG-227）。MG-227僅顯示中度MDM2降解作用，但具有非p53依賴性的高效細胞生長抑制作用，最終研究確定MG-227的靶點為GSPT1。綜合這些先前的研究不難看出，GSPT1是CRBN常見的新底物，它對抑制細胞增殖有重要作用。

因此，在這項研究中，威斯康星大學麥迪遜分校的科學家們也檢測了WB214是否也降解了GSPT1。結果顯示，相比MDM2和p53，WB214對GSPT1的降解作用最強，能夠以劑量依賴的方式消耗GSPT1。

白血病細胞降解特征（Western blot分析）。(A)細胞用DMSO或指定化合物處理6小時后MDM2、p53 和GSPT1的免疫印跡分析；(B) 細胞用DMSO或指定濃度WB214處理12小時后 GSPT1的免疫印跡分析。（來源：European Journal of Medicinal Chemistry）

最后，科學家們嘗試開發MDM2或GSPT1選擇性降解劑，通過改變WB214的不同基序，他們發現，盡管效力較弱，但“化合物36（compound 36）”能夠選擇性降解GSPT1。研究者們表示，接下來，他們將開展進一步研究，提高GSPT1選擇性降解劑的效力，同時開發優先降解MDM2的化合物。

在論文的討論部分，作者們指出，這項工作給他們帶來的一個很重要的教訓是，在開發蛋白降解劑時，與靶蛋白（如MDM2）結合的蛋白質（如p53）也可能作為“旁觀者”被降解。迄今為止報道的大多數新底物都是CRBN的，而隨著被用于開發蛋白降解劑的E3泛素連接酶家族變得更加壯大，脫靶效應可能發生得更多。

參考資料：

[1] BoWang et al. Development of MDM2 degraders based on ligands derived from Ugi reactions: Lessons and discoveries.European Journal of Medicinal Chemistry(2021).

[2] BoWang et al. Development of selective small molecule MDM2 degraders based on nutlin. European Journal of Medicinal Chemistry(2019).

來源：新浪醫藥。