【背景介紹】

光學成像具有非侵入性、復旦實時、大學快速反饋和高靈敏度等優點，張凡在活體生物醫學成像分析和傳感領域發揮著重要作用。復旦在外部光源激發時，大學復雜生物器官和組織中內源性熒光團產生的張凡自發熒光背景是獲得具有高信噪比（SNRs）成像的主要限制之一。因此，復旦生物發光成像、大學化學發光成像等無需外界光源照射的張凡成像策略引起了研究人員的極大興趣。目前，復旦生物發光成像已被廣泛用于跟蹤細胞、大學腫瘤成像等。張凡然而，復旦常規生物發光成像的大學可見光波長短（400-700 nm），在體內成像時存在組織穿透不夠、張凡靈敏度低等問題。通過生物發光共振能量轉移（BRET），生物發光成像的發射波長可擴展到近紅外I區（NIR-I，700-900 nm），有助于腫瘤和淋巴結成像以及酶活性分子成像，但其生物組織的散射效應依然影響成像的信噪比和分辨率。近紅外二區（NIR-II，1000-1700 nm）光學成像可以在深部組織（1 cm以上）中實現更高的空間分辨率。但是，活體內NIR-II熒光成像由于需要外部光照，不可避免地會出現自發熒光背景、并且會產生光致過熱效應、照明不均勻等不良現象。

【成果簡介】

近日，復旦大學的張凡教授和凡勇青年研究員（共同通訊作者）等人報道了一種生物發光探針（BPs），其通過使用一種特殊設計的花菁染料（FD-1029）進行生物發光共振能量轉移（BRET）和兩步熒光共振能量轉移（FRET），即可在1029 nm處的NIR-II區生物熒光成像。該NIR-II-BPs具有良好的生物相容性，并成功應用于小鼠的血管和淋巴管成像，其信噪比（SNRs）相對于NIR-II熒光成像和常規生物發光成像提高了5倍、空間分辨率高約1.5倍。此外，NIR-II-BPs還具有多重成像能力，可以實現多個指標的同時檢測。利用該生物發光探針的ATP響應特性，NIR-II-BPs能夠以高達83.4的高腫瘤與正常組織比率（tumor/normal tissue(T/N)）來識別腫瘤轉移。研究成果以題為“NIR-II bioluminescence for in vivo high contrast imaging and in situ ATP-mediated metastases tracing”發布在國際著名期刊Nature Communications上。

【圖文解讀】

圖一、具有NIR-II生物發光的NIR-II-BPs的示意圖

圖二、NIR-II-BPs的合成與表征
（a）FD-1029的合成路線；

（b） FD-1029在DSPE-PEG₂₀₀₀膠束中的吸收光譜；

（c）FD-1029在DSPE-PEG₂₀₀₀膠束中的熒光發射光譜；

（d）Cy5、Cy7.5、FD-1029的UV/VIS/NIR吸收和發射光譜以及螢光素酶的生物發光；

（e）NIR-II-BPs在PBS緩沖液中的TEM圖和的粒徑分布；

（f）NIR-II-BPs在PBS緩沖液中的生物發光發射光譜和吸收光譜；

（g）NIR-II-BP在小鼠血清中的光穩定性；

（h）不同檢測窗口中，在不同深度浸沒有1％脂質的NIR-II-BPs填充的毛細管生物發光圖像；

（i）以克（g）為單位的高斯擬合強度數據的FWHM與不同脂質內深度的關系。

圖三、NIR-II生物發光和熒光成像之間信噪比和光熱效應的差異
（a）光學成像示意圖；

（b）在5 mm雞胸組織下，NIR-II熒光成像和NIR-II生物發光成像；

（c）具有不同厚度雞胸組織的NIR-II-BPs毛細管的SNR，用于NIR-II熒光成像和NIR-II生物發光成像；

（d）對雞胸組織進行熱效應研究的示意圖；

（e）在808 nm、980 nm和1064 nm下連續照射30 min后，雞胸組織的光熱成像；

（f）在不同激發波長照射下，記錄的雞胸組織的溫度變化曲線；

（g） 在808 nm、980 nm和1064 nm下連續照射30 min后，裸鼠皮膚的溫度；

（h）在不同激發波長輻射下，記錄裸鼠皮膚的溫度變化曲線。

圖四、外部激發光對NIR-II生物發光和熒光成像信號均勻性的影響
（a）非均勻照明的照片和示意圖；

（b）在非均勻照明的NIR-II生物發光成像和NIR-II熒光成像中，填充NIR-II-BPs的光學成像；

（c）在NIR-II熒光成像和NIR-II生物發光成像中，沿毛細管的強度分布；

（d）典型的Gaussian point擴散函數光斑；

（e）d中的Gaussian point擴散函數中，沿虛線的強度曲線具有相同的顏色；

（f）關于非均勻照明的體內研究插圖；

（g-h）靜脈注射NIR-II-BPs后，小鼠淋巴管上的NIR-II生物發光成像和NIR-II熒光成像；

（i）沿g、h的紅色虛線的強度分布以及考慮到激發光強度分布的校正后的強度分布。

圖五、比較NIR-II生物發光和熒光信號在血管和淋巴管上成像
（a-c）在靜脈注射NIR-II-BPs后，小鼠腹部血管、淋巴管和腦血管的 NIR-II生物發光成像和NIR-II熒光成像；

（d-f）沿（a-c）白線的腹腔血管、淋巴管和腦血管的強度分布。

圖六、使用NIR-II-BPs進行體內多重成像
（a）對CT-26腫瘤小鼠的雙通道生物發光成像的照片；

（b）使用NIR-I-BPs和NIR-II-BPs對腫瘤組織、血管進行雙通道生物發光成像；

（c）淋巴系統雙通道生物發光成像的示意圖；

（d）使用NIR-I-BPs和NIR-II-BPs對淋巴系統進行雙通道生物發光成像。

圖七、ATP介導NIR-II-BPs對腫瘤和轉移瘤的成像
（a）裸鼠中相同腫瘤的VIS生物發光成像、NIR-II熒光成像和NIR-II生物發光成像；

（b）（a）中不同的光學成像方法的T/N比；

（c）在攜帶淋巴結轉移的裸鼠上，同時進行熒光成像和生物發光成像的示意圖；

（d）淋巴結轉移的熒光成像、生物發光成像和相應的高倍率成像；

（e）沿淋巴管的強度分布圖；

（f）腹膜轉移的NIR-II熒光成像和NIR-II生物發光成像；

（g）（f）中相應序列號腫瘤的T/N比；

（h）（f）中轉移性腫瘤邊緣的H＆E染色結果。

【小結】

綜上所述，作者利用工程化BRET和FRET工藝開發了具有生物相容性的NIR-II生物發光探針（NIR-II-BPs）。制備的NIR-II-BPs將生物發光范圍從Vis擴展到NIR-II。這種自發光方式完全消除了體內成像過程中外部激發光的不利影響，因而能夠實現血管和淋巴管以及腫瘤和轉移的高分辨率成像。此外，通過精心選擇熒光團、BRET-FRET方法可以成為一種實現具有不同發射波長的生物發光的通用方法，以滿足不斷增長的對高對比度多色成像和傳感的需求。但是，生物發光成像仍存在發射效率低、需要獨特的底物、對環境敏感的酶等缺點。這些缺點可能導致在體內NIR-II成像期間需要較長的成像時間、多次注入底物以及有限的生物環境。因此，未來需要開發具有更高靈活性和效率的可轉染NIR-II生物發光探針上。

文獻鏈接：NIR-II bioluminescence for in vivo high contrast imaging and in situ ATP-mediated metastases tracing.（Nature Communications, 2020, DOI: 10.1038/s41467-020-18051-1）

通訊作者簡介

張凡教授簡介：復旦大學教授、博士生導師 ，國家杰出青年基金獲得者、中組部青年拔尖人才（萬人計劃）。

學習工作經歷：

張凡教授于2008年獲復旦大學化學系理學博士學位（導師：趙東元院士）。2008-2010年美國加州大學圣塔芭芭拉分校化學與生物化學系博士后（導師：美國兩院院士Galen Stucky教授）。2010年8月通過復旦大學人才引進計劃加入復旦大學化學系，2012年協調成立復旦-陶氏化學聯合研究中心，任研究中心副主任，2013年底開始任復旦大學化學系教授。

研究興趣及獲獎：

張凡教授主要研究領域包括生物納米技術及生物分析, 如早期癌癥診斷與治療，藥物儲存與釋放，體內與體外生物成像等。發表SCI論文100余篇，多篇以通訊作者發表在Nat. Nanotechnol (1篇)，Nat. Commun（6篇），J. Am. Chem.Soc.（4篇），Angew. Chem. Int. Ed.（13篇），Adv. Mater. (6篇），Nano. Lett. (5篇）等生物化學相關國際一流期刊上，引用超過13000次，H index 62。25篇論文入選ESI“Highly Cited Papers”。2018年入選科睿唯安全球高被引學者。撰寫出版英文專著2部（英國皇家化學會出版社和德國Springer-Nature出版社）。

獲得教育部自然科學一等獎、侯德榜化工科技獎、上海市科技進步獎等獎、上海市青年英才科技獎等榮譽。受邀在國際會議上作大會邀請報告30余次，同時擔任國際期刊Frontiers in Chemistry (Nanoscience Section)執行主編，Wiley出版社Small Structure, Particle & Particle systems characterization 和Analysis and Sensing以及《化學學報》、《分析化學》等國內外學術期刊編委。

本文由CQR編譯。

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