蛋白激酶將磷酸基團(tuán)從ATP搬運(yùn)到蛋白多肽底物上的檢測(cè)絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，蛋白直接影響方針的磷酸活性和功用。放射性研討標(biāo)明，種方真核細(xì)胞中大概30%的檢測(cè)蛋白通過磷酸化潤(rùn)飾。這一要害的蛋白翻譯后潤(rùn)飾調(diào)控了廣泛的細(xì)胞活性，包含細(xì)胞周期、磷酸分解、種方代謝和神經(jīng)元通訊。檢測(cè)此外，蛋白反常的磷酸磷酸化事情與許多疾病狀況關(guān)聯(lián)。在評(píng)價(jià)磷酸化時(shí)，種方挑選的檢測(cè)辦法可以會(huì)有所不一樣，這取決于多個(gè)要素，蛋白包含提出的磷酸具體問題以及特別儀器或試劑的可用性。怎么檢測(cè)蛋白磷酸化，這篇文章扼要介紹了幾種常用辦法，并提出了每種辦法的長(zhǎng)處和缺陷。
激酶活性分析

蛋白激酶一般是多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的常見組分，它們影響了很多擔(dān)任生物反響的下流效應(yīng)物，因而，評(píng)價(jià)某個(gè)特定激酶的活性可以為平行通路供給名貴信息。生物學(xué)樣品中的激酶活性一般是在體外測(cè)定的，在ATP的存鄙人將免疫沉淀的激酶與外源底物一起孵育。之后通過一些陳述體系來(lái)評(píng)價(jià)特定激酶對(duì)底物的磷酸化，包含顯色、放射性或熒光檢測(cè)。此外，R&D Systems還供給非放射性的Universal Kinase Activity Kit，可以定量任何可發(fā)生ADP的激酶的活性。雖然咱們可以取得有關(guān)特定激酶行動(dòng)的信息，但評(píng)價(jià)細(xì)胞提取物中的酶活性僅僅揭開了信號(hào)通路的冰山一角。咱們對(duì)蛋白怎么被潤(rùn)飾還知之甚少，且體外活性剖析也不能闡明內(nèi)源磷酸酶活性的潛在作用。磷酸化蛋白的直接檢測(cè)可以為細(xì)胞怎么應(yīng)對(duì)外界影響供給更具體的剖析，由于磷酸化肽段的判定為蛋白的表達(dá)和功用狀況供給信息。
磷酸化特異抗體的開發(fā)

直接測(cè)定蛋白磷酸化的一種經(jīng)典辦法是將整個(gè)細(xì)胞與放射性標(biāo)記的32P-磷酸鹽一起孵育，取得細(xì)胞提取物，通過SDS-PAGE別離，并曝光在膠片上。這種繁瑣的辦法需求屢次幾小時(shí)的孵育，且運(yùn)用放射性同位素。其他傳統(tǒng)辦法包含2D凝膠電泳，這種技能假定磷酸化會(huì)改變蛋白的遷移率和等電點(diǎn)。
鑒于這些辦法很吃力，磷酸化依靠抗體的開發(fā)遭到研討人員的極大歡送。1981年，第一個(gè)有記載的磷酸化抗體在兔子中發(fā)生，運(yùn)用的是鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白（KLH）的苯甲酰磷酸聯(lián)系物。這一抗體廣泛地識(shí)別了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后，運(yùn)用組成的磷酸化肽段來(lái)免疫兔子，開宣布多個(gè)磷酸化狀況特異抗體，這些磷酸化肽段代表了方針蛋白磷酸化位點(diǎn)周圍的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，發(fā)生高度特異的免疫試劑。磷酸化特異抗體的出現(xiàn)為傳統(tǒng)辦法的改善以及新的免疫剖析技能的開發(fā)打開了大門。在任何技能中運(yùn)用磷酸化特異抗體的勸告是，成功的檢測(cè)依靠于抗體與意圖磷酸化蛋白的特異性和親和力。
Western Blot
Western blot是評(píng)價(jià)蛋白磷酸化狀況的最常用辦法，大多數(shù)細(xì)胞生物學(xué)試驗(yàn)室都具有展開這些試驗(yàn)的設(shè)備。運(yùn)用SDS-PAGE別離生物樣品，隨后搬運(yùn)到膜上（一般是PVDF或尼龍膜），之后運(yùn)用磷酸化特異的抗體來(lái)判定意圖蛋白。典型的Western blot試驗(yàn)過程防止了運(yùn)用放射性同位素時(shí)的危險(xiǎn)品和廢物處置需求。許多磷酸化特異抗體非常活絡(luò)，可輕松檢測(cè)慣例樣品（如10-30 µg細(xì)胞提取物）中的磷酸化蛋白。由于測(cè)得的磷酸化蛋白水平可以隨處置或凝膠上樣差錯(cuò)而改變，研討人員常常運(yùn)用一個(gè)抗體來(lái)檢測(cè)同源蛋白的總水平（而不思考磷酸化狀況），以斷定磷酸化組分相關(guān)于總組分的份額，并充當(dāng)上樣內(nèi)對(duì)照。化學(xué)發(fā)光和顯色法都很常用，而分子量marker常用來(lái)供給蛋白分子量的信息。
酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）
ELISA已逐步變成測(cè)定蛋白磷酸化的一種有力辦法。ELISA的定量才能優(yōu)于Western blot，且在調(diào)理激酶活性和功用的研討中表現(xiàn)出無(wú)窮的作用。這種微孔板方式的剖析一般運(yùn)用意圖蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀況無(wú)關(guān)。隨后讓意圖蛋白聯(lián)系在抗體包被的剖析板中，意圖蛋白可所以純的，也可所以雜亂的異質(zhì)樣品（如細(xì)胞裂解液）中的一個(gè)組分。參加待剖析的磷酸化位點(diǎn)特異的檢測(cè)抗體。這些剖析一般描繪為顯色或熒光檢測(cè)。發(fā)生的信號(hào)強(qiáng)度與開始樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。與更為傳統(tǒng)的免疫印跡比擬，磷酸化特異的ELISA技能具有一些長(zhǎng)處。首要，運(yùn)用通過校準(zhǔn)的規(guī)范品，可輕松定量成果。其次，以三明治方式運(yùn)用意圖蛋白特異的兩個(gè)抗體，帶來(lái)了高的特異性。第三，ELISA的活絡(luò)度更高答應(yīng)運(yùn)用更少數(shù)樣品，檢測(cè)低豐度的蛋白。最終，微孔板方式的通量比傳統(tǒng)的Western blotting要高得多。ELISA一般帶來(lái)了激酶活性的直接測(cè)定。不過，另一類ELISA技能運(yùn)用固定化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測(cè)辦法，帶來(lái)激酶活性的更直接測(cè)定。
基于細(xì)胞的ELISA
雖然體外生物化學(xué)激酶剖析（如典型的三明治ELISA）常用于假設(shè)查驗(yàn)和藥物挑選，但它們無(wú)法仿制細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境。剖析完好細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化或許能更精確地代表特定信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的狀況。一些免疫剖析近來(lái)被開宣布來(lái)，可以在完好細(xì)胞的布景下測(cè)定蛋白磷酸化。細(xì)胞在同一個(gè)孔中被影響、固定和阻斷。運(yùn)用磷酸化特異抗體，運(yùn)用熒光或顯色檢測(cè)體系來(lái)評(píng)價(jià)磷酸化狀況。此外，在微孔板的同一個(gè)孔中一起檢測(cè)磷酸化蛋白和總蛋白。因而，來(lái)自意圖蛋白的信號(hào)可通過第二種蛋白來(lái)規(guī)范化，校對(duì)各孔之間的區(qū)別，完結(jié)磷酸化蛋白水平的精確評(píng)價(jià)，并比擬多個(gè)樣品，與傳統(tǒng)免疫印跡中運(yùn)用磷酸化特異和總蛋白抗體類似。這些剖析繞過了制備細(xì)胞裂解液的需求，因而更適合高通量剖析。

細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)和ICC/IHC

傳統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫安排化學(xué)（ICC/IHC）是檢測(cè)磷酸化事情的有力東西。流式細(xì)胞儀運(yùn)用激光來(lái)激起用于抗體檢測(cè)的熒光染料。在評(píng)價(jià)同一個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)蛋白時(shí)，有必要精心挑選濾光片組合和熒光染料，其光譜不能堆疊。流式細(xì)胞術(shù)很有優(yōu)勢(shì)，因其完結(jié)了疾速、定量的單細(xì)胞剖析。通過細(xì)胞外表象征的分型可檢測(cè)異質(zhì)集體中特定細(xì)胞類型的蛋白，而無(wú)需在物理上別離細(xì)胞。通過這種辦法可剖析稀有的細(xì)胞集體，而不必憂慮細(xì)胞丟失或細(xì)胞分選過程中可以發(fā)生的蛋白表達(dá)改變。
ICC一般指的是運(yùn)用顯微鏡對(duì)培育細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行檢測(cè)，而IHC指的是對(duì)完好安排切片中的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。與流式細(xì)胞術(shù)類似，這些技能完結(jié)了細(xì)胞或安排內(nèi)多個(gè)蛋白的評(píng)價(jià)，僅僅要滿足注重，防止熒光光譜或色彩的堆疊。熒光和顯色檢測(cè)技能都常常運(yùn)用。與監(jiān)控磷酸化的其他方式不一樣，ICC一般是斷定細(xì)胞內(nèi)定位的首選辦法。流式細(xì)胞術(shù)和ICC/IHC都需求高親和力、高特異性的抗體、阻斷過程、對(duì)照和抗體滴定，以防止因非特異性聯(lián)系而帶來(lái)的不明確成果。
通過流式細(xì)胞術(shù)和ICC來(lái)檢測(cè)磷酸化蛋白需求蛋白是安穩(wěn)的，且抗體可以挨近。細(xì)胞一般通過影響，并由甲醛或多聚甲醛固定，以交聯(lián)磷酸化蛋白，使其安穩(wěn)，便于剖析。固定后的細(xì)胞有必要通過透化處置，讓磷酸化特異抗體可進(jìn)入細(xì)胞。關(guān)于不一樣的亞細(xì)胞定位，一般運(yùn)用不一樣的透化技能。溫文的去垢劑可完結(jié)細(xì)胞質(zhì)蛋白的檢測(cè)，而抗體要想挨近核蛋白，可以需求運(yùn)用酒精。酒精透化也可增強(qiáng)磷酸化特異抗體的磷酸化蛋白檢測(cè)，因酒精具有變性的特色。

質(zhì)譜
雜亂的生物樣品（如細(xì)胞裂解液）中蛋白質(zhì)磷酸化的全部評(píng)價(jià)（磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)）關(guān)于知道根據(jù)磷酸化的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)很重要。雜亂的蛋白混合物中大規(guī)劃的磷酸化蛋白剖析包含磷酸化蛋白和磷酸化肽段的判定，以及磷酸化殘基的測(cè)序。質(zhì)譜（MS）技能是完結(jié)這些使命的有用東西。雖然質(zhì)譜在判定單個(gè)蛋白上具有超卓的活絡(luò)度和分辨率，但關(guān)于磷酸化蛋白的剖析，還有一些固有的艱難。首要，磷酸化肽段的信號(hào)一般較弱，由于它們帶負(fù)電荷，而電噴霧質(zhì)譜在正電方式下作用，因而電離作用欠好。其次，在很多非磷酸化蛋白的高布景之下，很難觀察到低豐度意圖蛋白的信號(hào)。為了戰(zhàn)勝這些缺陷，大家現(xiàn)已開宣布一些富集戰(zhàn)略，包含固定化金屬親和層析（IMAC）、磷酸化特異抗體富集、化學(xué)潤(rùn)飾法（如磷酸化絲氨酸和蘇氨酸的β-消去反響），以及用生物素化的基團(tuán)替代磷酸基團(tuán)。

多個(gè)分析物圖譜分析
質(zhì)譜技能如磕碰誘導(dǎo)解離（CID）和電子搬運(yùn)解離（ETD），供給了肽段序列和翻譯后潤(rùn)飾（磷酸化）的全部平行剖析。這些技能適當(dāng)吃力，而當(dāng)特定通路作為首要研討方針時(shí)，可以不需求全部的磷酸化剖析戰(zhàn)略。這致使一些一起測(cè)定多個(gè)剖析物的蛋白磷酸化的新辦法被開宣布來(lái)。總的來(lái)說，這些辦法涉及到磷酸化特異抗體的運(yùn)用，包含根據(jù)微孔板、磁珠和膜，根據(jù)磁珠和根據(jù)膜的檢測(cè)方式。這些剖析最顯著的優(yōu)點(diǎn)在于通量才能被大大提高，防止了運(yùn)轉(zhuǎn)多個(gè)Western blot或傳統(tǒng)的ELISA剖析的需求。這些技能也可以供給更多的數(shù)據(jù)，而所需的樣品量很少。相應(yīng)地，蛋白圖譜剖析一般被以為活絡(luò)度不及傳統(tǒng)的對(duì)應(yīng)技能，因潛在的抗體穿插反響性。

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